MATERIEL ET METHODES
HBEGF CATCGTGGGGCTTCTCATGT CCAGCCGATTCCTTGAGCA
5. Expérimentations animales
Pour la formation des sphères, les cellules sont ensemencées dans les puits de ces plaques dans du milieu DMEM/F-12 1 :1 (Gibco, Thermo Fisher, USA) supplémenté avec du B27 1X (Gibco, Thermo Fisher, USA), de l’EGF (20 ng/ml, StemCell Technologies, USA) et du bFGF (20 ng/ml, Promokine).
1000 cellules/ml par puits sont ensemencées et incubées à l’étuve. Après 10 jours de culture, les sphères sont soit comptées au microscope DMi8 (Leica Biosystems, Allemagne) soit récupérées pour extraction des ARN en vue de la réalisation d’une qPCR.
5. Expérimentations animales
Toutes les expériences in vivo ont été réalisées au sein de l’Animalerie Haute Technologie de l’Université de Lille et en accord avec un protocole approuvé par le comité d’éthique pour l’expérimentation animale. Les souris utilisées pour la tumorigénicité ou la formation de métastases pulmonaires sont des souris immunodéficientes NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ ou NSG. Pour les analyses de toxicité, les souris utilisées sont des souris C57Bl/6J (Envigo, France).
Pour permettre le suivi des cellules et de la croissance tumorale, des modèles des lignées 786-O et CAKI-2 exprimant le gène de la luciférase ont été générées par transduction lentivirale et sélection à la puromycine à 5 µg/ml pendant 1 semaine.
5.1. Implantation orthotopique de cellules
L’implantation des cellules est réalisée chirurgicalement et orthotopiquement, soit sous la capsule rénale, soit par injection dans le parenchyme au niveau du pôle inférieur du rein. 24h après leur infection, les cellules exprimant alors les différents shRNA sont
MATERIEL ET METHODES
156
implantées aux souris. Les injections sont réalisées sous poste de sécurité microbiologique, selon les bonnes pratiques chirurgicales.
L’analgésie des souris nécessaire à la procédure chirurgicale est obtenue par l’administration intrapéritonéale de buprénorphine (0,1 mg/kg). Les souris sont anesthésiées par un mélange air-isoflurane (5% en induction dans une cuve, 3% en entretien au masque), placées sur le ventre, légèrement tournées sur le côté droit. Après rasage des poils, détersion et désinfection, la peau est incisée au niveau du flanc gauche puis l’incision de la paroi abdominale permet de localiser le rein gauche qui est délicatement extériorisé au niveau du site de l’incision. Le rein est humidifié au sérum physiologique stérile et les cellules sont injectées à l’aide de seringues à insuline 29G (Myjector, Terumo) soit sous la capsule rénale (CAKI-2), soit à 1mm dans le parenchyme au pôle inférieur du rein (786-O).
Pour limiter le risque de fuites, les cellules sont suspendues dans un mélange de sérum physiologique et de 10% de Matrigel (Corning, USA). Après l’injection, l’aiguille est alors maintenue en place quelques instants afin que le Matrigel puisse se solidifier et maintenir les cellules en place. Pour la lignée CAKI-2Luc, 0,5 millions de cellules sont injectées dans un volume de 10µL. Pour la lignée 786-OLuc, 2 millions de cellules sont injectées dans un volume de 20µL. Une fois l’implantation terminée, le rein est replacé dans la cavité abdominale qui est suturée à l’aide de fil résorbable (PDS-11, Ethicon). La peau est ensuite fermée à l’aide d‘agrafes (Autoclip 7mm) qui sont retirées entre 10 et 14 jours post-chirurgie. Le suivi par bioluminescence est débuté dès le lendemain de la chirurgie.
5.2. Formation de métastases pulmonaires
Pour la génération du modèle métastatique, 400'000 cellules 786-OLuc sont injectées par voie intraveineuse dans la veine caudale dans 100µL de sérum physiologique. Après suivi de l’implantation par imagerie de bioluminescence, les souris sont sacrifiées 4 à 5 mois post-injection des cellules et les poumons sont collectés. Les tumeurs formées sont disséquées indépendamment et dissociées mécaniquement sur un tamis de 70 µm (Falcon, BD Biosciences, USA) avant d’être lavées et réensemencées dans du milieu de culture. Après quelques jours, les cellules sont de nouveau lavées afin de retirer les débris de l’organe et les cellules mortes, puis du milieu frais de culture des cellules est ajouté. Après plusieurs jours, des cellules de morphologie épithéliale sont obtenues et sont sélectionnées par l’utilisation de puromycine (5 µg/ml) grâce à
MATERIEL ET METHODES
157 l’expression d’un gène de résistance co-exprimé avec le gène de la luciférase. Les cellules obtenues sont ensuite maintenues en culture de la même façon que la lignée parentale 786-O sans sélection.Les cellules 786-OM1 (M pour métastase) obtenues sont alors infectées pour l’expression des différents shRNA et 500'000 cellules de chaque condition sont injectées par voie intraveineuse dans la veine caudale dans 100 µL de sérum physiologique à d’autres lots de souris.
Le suivi de bioluminescence est alors débuté 2h après l’injection des cellules.
5.3. Suivi par imagerie de bioluminescence
Pour toutes les expériences, le suivi par imagerie de bioluminescence est réalisé de façon hebdomadaire. Pour cela, le substrat de la luciférase, la D-luciférine, est injecté aux souris par voie intrapéritonéale à la dose de 150 mg/kg (XenoLight D-luciferin, Perkin Elmer, USA). Les souris sont ensuite anesthésiées par un mélange oxygène-isoflurane (5% induction, 3% entretien) et les signaux de luminescence sont acquis très exactement 10min après l’injection de la luciférine par l’appareil IVIS XENOGEN 50 (Perkin Elmer, USA). Les acquisitions sont réalisées en mode exposition automatique pour toutes les souris. La quantification du signal de bioluminescence est ensuite réalisée avec le logiciel LivingImage 3.2 (Perkin Elmer, USA).
5.4. Analyse histologique des organes au sacrifice
Au sacrifice, les organes sont pesés, photographiés et fixés par immersion dans du formaldéhyde 4% pendant 24h avant d’être transférés dans l’éthanol 70% dans l’attente de leur déshydratation et inclusion au sein du plateau d’histologie de la Faculté de Médecine de Lille.
Des coupes de 5 µm d’épaisseur sont réalisées au microtome et déposées sur lames. Les coupes sont déparaffinées par immersion dans plusieurs bains séquentiels de xylène, réhydratées avant d’être colorées par hématoxyline et éosine. Après rinçage, les coupes sont déshydratées à l’aide de concentrations croissantes d’éthanol en terminant par plusieurs bains de xylène et montées entre lame et lamelle à l’aide du milieu de montage Pertex®.
Les coupes complètes sont numérisées et virtualisées grâce au scanner de lames AxioScan Z1 (Carl Zeiss Microscopy, Allemagne).
MATERIEL ET METHODES
158
5.5. Évaluation de la toxicité des composés DB818 et DB1055
Le sang des souris traitées au DB818 et DB1055 pendant 1 semaine à raison de 3 administrations à la dose de 30 mg/kg est prélevé à jour 8 et jour 15 (Figure 73) par ponction submandibulaire et collecté en microtube EDTA ou hépariné (Microvette, Sarstedt, Allemagne). La numération sanguine est réalisée sur l’analyseur vétérinaire VetScan® HM5 le plus rapidement possible après le prélèvement. Pour la biochimie, la technologie de chimie sèche sur l’analyseur de biochimie vétérinaire IDEXX VetTest Chemistry Analyzer a été utilisée pour doser les paramètres suivants : créatinine, urée, ALAT, ASAT.