MATERIEL ET METHODES
3. Biologie moléculaire 1. Système lentiviral
Les composés DB818 et DB1055 sont obtenus par collaboration avec l’équipe des Prs David Boykin et David Wilson de l’Université d’Atlanta (Géorgie, USA). Les composés sont solubilisés dans l’eau à la concentration finale de 10 mM, aliquotés et stockés à -20°C.
2. Analyse in silico
L’analyse in silico a été réalisée à l’aide de la base de données TCGA (The CancerGenome Atlas). Les données d’expression d’HOXA9 par RNA-seq, de CNV (copy number variation) et les données clinico-pathologiques ont été téléchargées sur le site du National
Cancer Institute - Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov) et sur le site du
Broad Institute (http://firebrowse.org). Deux bases ont été utilisées pour l’analyse : KIRC constituée de données de patients atteints de carcinome rénal à cellules claires et KIRP constituée de données de patients atteints de carcinome rénal papillaire.
Pour l’analyse de l’expression d’HOXA9, les données des échantillons normaux présents dans chaque base ont été utilisées en comparaison et des Z-scores calculés selon la formule (Expressionéchantillons – Moyenneéchantillons normaux)/(Standard Deviationéchantillons normaux). Pour les analyses de survie et d’association avec les données clinico-pathologiques, deux groupes ont été formés selon l’expression d’HOXA9 : le groupe High représentant le tiers de patients exprimant le plus HOXA9 et le groupe Low représentant le tiers de patients exprimant le moins HOXA9.
3. Biologie moléculaire
3.1. Système lentiviral
3.1.1. Plasmides
Pour la production du système lentiviral, différents plasmides d’ADN sont utilisés :Nom Origine/référence Utilisation
pRRL shCTR Addgene #19125 Transgènes shCTR, GFP
pRRL shHOXA9-1F2 Séquences shRNA
de Faber et al., 2009 Transgènes shHOXA9, GFP pRRL shHOXA9-1F3
pLenti CMV Puro LUC Addgene #w168-1 Transgène Firefly Luciferase, gène de résistance à la puromycine
psPAX2 Addgene #12260 Empaquetage
pMD2.G Addgene #12259 Enveloppe - VSVG
MATERIEL ET METHODES
146
3.1.2. Amplification des plasmides par transformation bactérienne
Les bactéries Escherichia coli Stbl3 cultivées à 37°C sous agitation en milieu LB liquide (Lysogeny Broth, Thermo Fisher, USA) sont rendues compétentes par la méthode au CaCl2. Pour cela, au cours de la phase exponentielle de croissance (densité optique à 600nm entre 0,4 et 0,5), les bactéries sont centrifugées et resuspendues deux fois séquentiellement dans une solution glacée contenant CaCl2 à 60mM, 15% glycérol et PIPES à 10mM (Sigma Aldrich, USA), pH 7 avant d’être placées 30min sur la glace, centrifugées à nouveau et resuspendues dans le milieu contenant le CaCl2 avant d’être aliquotés puis conservés à -80°C.
La transformation est réalisée par choc thermique en présence de 300ng de plasmide à amplifier : 20min dans la glace, 90sec à 42°C puis 5min dans la glace. Les bactéries sont ensuite cultivées pendant 1h à 37°C dans du milieu riche SOC (Thermo Fisher, USA) pour permettre l’expression de la cassette de résistance (ampicilline pour tous les plasmides utilisés). 160 µL de cette solution sont ensuite étalés sur milieu LB Agar (Lysogeny Broth Agar, Thermo Fisher, USA) contenant 50 µg/ml d’ampicilline (Sigma Aldrich, USA) et incubés à 37°C sur la nuit. Au matin, les clones isolés sont ensemencés dans 10 mL de milieu LB supplémenté avec 50 µg/ml d’ampicilline, cultivées sur la journée avant d’être amplifiés dans 200 mL du même milieu de culture pendant 14 heures.
3.1.3. Purification des plasmides
La purification des plasmides est réalisée en maxi-, midi- ou mini-prep selon le volume de culture bactérienne à l’aide des kits NucleoBond Plasmid DNA EF (Macherey-Nagel, USA) selon les recommandations du fournisseur.
3.1.4. Dosage et vérification des plasmides
La concentration des plasmides obtenus est déterminée par spectrophotométrie sur le Nanodrop 1000 (Thermo Fisher, USA). La taille des plasmides est vérifiée par migration électrophorétique sur gel d’agarose 1%. La séquence peut être vérifiée par séquencage par la société GATC Biotech (Allemagne).
MATERIEL ET METHODES
147
3.1.5. Production des lentivirus
Les lentivirus produits sont des systèmes lentiviraux de 2ème génération et nécessite la co-transfection de 3 plasmides : transgène, empaquetage et enveloppe. Les systèmes utilisés sont dits SIN pour self-inactivated virus, empêchant la réplication après infection dans les cellules. Pour la production, la lignée HEK-293T/17 (ATCC CRL-11268™) est utilisée. 3 millions de cellules sont ensemencées, cultivées pendant une nuit dans du milieu DMEM contenant 10% de SVF avant d’être co-transfectées au matin par transfection chimique au CaCl2 avec les 3 plasmides : 10µg de pRRL ou pLenti, 7,5µg de psPAX2 et 3,75µg de pMD2.G.
Après 4 à 6h de contact, le milieu contenant les plasmides est remplacé par du milieu DMEM frais. Les cellules sont alors cultivées à 37°C, 5% de CO2 sous atmosphère saturée en humidité pendant 48h. Le surnageant contenant les lentivirus produits pendant ces 48h est récupéré, filtré sur unité de filtration Stericup avec membrane 0,45 µm (Merck Millipore, USA) puis centrifugé deux fois à ultra haute vitesse (19000g) pendant 90 minutes à 4°C. Le culot de lentivirus est resuspendu délicatement dans un volume adéquat de PBS/BSA 1% avant d’être aliquoté et conservé à -80°C avant utilisation.
3.1.6. Titration des lentivirus
Afin de normaliser les infections lentivirales sur les cellules d’intérêt, les lentivirus obtenus sont titrés par détermination de la quantité d’antigène p24 par test ELISA (HIV-1 p24 Antigen ELISA, RETROtek, Gentaur).
Néanmoins et puisque que la probabilité d’obtenir des particules virales ne contenant pas le transgène/shRNA n’est pas nulle, une deuxième méthode de titration, plus fonctionnelle, est réalisée grâce à l’expression de la GFP (co-exprimée avec chaque transgène/shRNA) après infection d’environ 100000 cellules HEK-293T en plaque 6 puits avec des quantités croissantes de lentivirus. Après 48h, les cellules sont fixées au formaldéhyde 4% (Sigma Aldrich, USA), lavées au PBS et analysées par cytométrie en flux (CyAn ADP, Beckman Coulter, USA). Le nombre de particules virales/µL dans la suspension de lentivirus est déterminé à l’aide du pourcentage de cellules GFP+.
3.2. Analyse de l’expression des gènes
3.2.1. Extraction et dosage d’ARN
L’extraction des ARN totaux est réalisée avec deux kits différents selon le nombre de cellules disponibles : Nucleospin RNA XS (<0,5 millions) ou Nucleospin RNA
MATERIEL ET METHODES
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(Macherey-Nagel, USA) selon les recommandations de chaque kit. L’élution est réalisée dans le volume recommandé par chaque kit. Le dosage est réalisé au Nanodrop 1000 (Thermo Fisher, USA) et les ARN sont conservés à -80°C.
3.2.2. Rétro-transcription
Les ARN totaux sont rétro-transcrits en ADN complémentaire (ADNc) afin d’être utilisés pour la PCR quantitative. Pour cela, 1µg (ou moins) d’ARN sont rétro-transcrits à l’aide du kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA). La transcription se déroule à l’aide d’amorces aléatoires. La rétro-transcription est réalisée selon le programme recommandé par le fournisseur sur le thermocycleur GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) : 10min à 25°C – 2h à 37°C – 5min à 85°C puis 4°C jusqu’à conservation à -20°C.
3.2.3. Analyse transcriptomique par puce à ADN
L’analyse transcriptomique a été réalisée sur la lignée 786-O en 4 à 5 réplicats indépendants pour chaque condition à 48h post-infection : shCTR, shHOXA9-AF2 et shHOXA9-1F3. Les ARN des cellules ont été extraits et dosés selon la méthode décrite au 3.2.1. La suite de l’expérience a été réalisée au sein de la plateforme de Génomique Fonctionnelle et Structure de l’Université de Lille (Dr Martin Figeac).
Le rendement et la qualité des ARNs totaux ont été évalués sur le bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Massy, France). Des puces à ADN (039494_D_F_20150612, SurePrint G3 humain GE v2 8x60K Microarray, Agilent Technologies) ont été utilisées pour analyser l'expression des gènes. Le marquage, l'hybridation et la détection de l'ARNc ont été effectués conformément aux instructions du fournisseur (Agilent Technologies). Pour chaque puce, des ARNc marqués à la cyanine 3 ont été synthétisés avec le kit de marquage QuickAmp et ceci à partir de 50 ng d'ARN total. Un calibrateur interne est ajouté dans tous les tubes et utilisés comme contrôle positif des étapes de marquage et d'amplification. Les ARNc marqués ont été purifiés et 600 ng ont ensuite été hybridés sur les puces pendant 17h à 65°C. Après plusieurs étapes de lavage, les puces ont été scannées sur un scanner Agilent G2505C et les données extraites à l'aide du logiciel Agilent Feature Extraction © (FE version 10.7.3.1). L’analyse statistique a été réalisée avec le logiciel Genespring par un t-test modéré avec correction de Benjamini-Hochberg. Le shCTR sert de contrôle pour les conditions shHOXA9. La valeur de p retenue pour la significativité est 0,05.
MATERIEL ET METHODES
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3.2.4. Analyse par le logiciel GSEA
L’analyse globale a été réalisée avec le logiciel GSEA (GeneSet Enrichment Analysis Desktop v3.0) afin de mettre en évidence les ensembles de gènes (genesets) impliqués dans des fonctions biologiques spécifiques. Pour cela, les données normalisées d’expressions des différentes conditions ont été comparées par le logiciel. Les genesets significativement enrichis ont été sélectionnés sur la base de leur p-value <0.05 et de leur valeur de FDR (false discovery rate) <0.25.
3.2.5. PCR quantitative
La PCR quantitative ou qPCR permet de réaliser une amplification par PCR (polymerase chain reaction) et de suivre par fluorescence la quantité de copies d’une cible générée, permettant de connaître la quantité de départ dans un échantillon par la détermination du cycle seuil (ou Ct). La qPCR est réalisée à l’aide de SYBR Green qui est un agent à la fois ligand du petit sillon et intercalant de l’ADN capable de fluorescer lorsqu’il est lié. Sa fluorescence suivie après chaque cycle de PCR est proportionnelle à la quantité d’ADN et augmente de façon exponentielle à chaque cycle.
Les amorces utilisées pour la détermination de l’expression des gènes sont établies à l’aide du logiciel Primer-BLAST (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) et synthétisées à la demande par la société Eurogentec (Belgique). Pour chaque couple d’amorces (Forward/Reverse), l’efficacité est validée à l’aide de quantités croissantes d’ADNc et la spécificité est contrôlée par la détermination du Tm ou température de fusion de l’amplicon et le séquençage de ce dernier par la société GATC Biotech (Allemagne). Les couples d’amorces utilisées sont présentés dans le Tableau 10. Le mélange réactionnel pour un puits est alors constitué de 10 µL de SYBR Green Master Mix 2X (Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA) comprenant la Taq polymérase avec son tampon, le SYBR Green et les nucléotides, auxquels sont ajoutés 0,8 µL d’amorces à 5 µM (200 nM final), 5,2 µL d’eau sans nucléase et 4µL de cDNA à la concentration de 2,5 ng/µL (10 ng). La qPCR est réalisée en plaque spécifique 96 puits après scellement et centrifugation de la plaque sur l’appareil StepOnePlus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA). Après 10 min à 95°C pour activer la Taq polymerase, 40 cycles sont réalisés selon le programme : 15 sec à 95°C – 1 min à 60°C.
MATERIEL ET METHODES
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Gène Amorce Forward 5’-3’ Amorce Reverse 5’-3’
ANKRD1 GCAAAAATTAGCGCCCGAGA ACGGGGTATCTCCTTCTCTGT
ANKRD52 GTCAACGAGGCCGACTGTAA GGGTTCCGCTCTCCTGTAAG
AREG TTGATACTCGGCTCAGGCCA CTCCCGAGGACGGTTCACTA
BMP2 CGCAGCTTCCACCATGAAGAATC AGGTGATAAACTCCTCCGTGGG
CXCR4 GCTGTTGGCTGAAAAGGTGG ATCTGCCTCACTGACGTTGG