Expériences in vivo

Etant donné la difficulté de sélection de souches sur la seule base des essais in vitro, des essais préliminaires ont été réalisés in vivo, chez la souris, pour 5 souches pré-sélectionnées, afin de définir leur capacité de colonisation vésicale et de passage à l’infection urinaire. L’objectif était de sélectionner la souche ayant la meilleure capacité de colonisation vésicale. Sur la base des données de la littérature, de leur description (tableau 4) et des résultats des essais in vitro, 5 souches d’E.coli ont été pré-sélectionnées : ABU 83973, UTI89, MG1655, GGB1561 (souche parente MG1655, FimH+), CFT073.

Animaux et conditions générales d’expérimentation

Les animaux utilisés sont des souris femelles C-57BL6 de 8 semaines. Après réception (animalerie de l’UFR de Pharmacie, Toulouse), les souris ont été hébergées en cages collectives (5 souris par cage) pendant 7 jours, afin de leur permettre de s’acclimater en dehors de tout stress.

L’inoculation des animaux se déroulent toujours comme suit :  anesthésie par inhalation d’isoflurane,

 désinfection du méat uréthral (PVPI), et cathétérisme vésical sur guide

 vacuité vésicale vérifiée par expression digitale (pooling des urines pour détection de bactéries – contrôle de stérilité)

 instillation de 50 microlitres de suspension d’E.coli ajustée à 2.108

UFC/ml,  maintien du sommeil pdt 45 min, en décubitus dorsal

Le sacrifice des animaux se déroule toujours comme suit :  anesthésie par inhalation d’isoflurane

 sacrifice par injection intra-péritonéale de xylocaïne à 1%

 prélèvement des vessies par laparotomie médiane large, extension en pyjama, dégagement de la vessie, clampage au niveau du col vésical, extraction et dépose de la vessie pleine dans un cryotube de 10ml.

3.2.2.1 Inoculation de différentes souches d’E.coli en l’absence de pré-incubation avec C102

a) Cinétique de l’excrétion urinaire d’E.coli et persistance d’E.coli dans la paroi vésicale Pour chacune des 5 souches pré-sélectionnées, 12 souris sont parallèlement inoculées avec la même souche et la même suspension (50 microlitres de suspension d’E.coli ajustée à 107

UFC/50 microlitres en tampon PBS (soit 2.108 UFC/ml). Les animaux sont ensuite placés dans une boîte « post-interventionnelle », en atmosphère d’isoflurane pendant 15 mn puis, placées par groupes de 12 en 10 cages métaboliques (5 groupes, 60 souris en tout).

A des temps définis (J1, J3, J7, J14), les animaux sont pesés, placés au plus par 6 dans des cages métaboliques sans eau de boisson, avec un buvard neuf. Après 1 heure de repos, 3 souris sont soustraites, à nouveau pesées, endormies et injectées (injection IP 200 microlitres de furosémide, 20mg/50ml). Elles sont ensuite sacrifiées et les vessies prélevées.

La caractérisation de la colonisation est réalisée par dénombrements des UFC d’E.coli au niveau de différents types d’échantillons :

-l’urine des mictions spontanées est recueillie sur buvard, le volume d’urine est estimé à partir du diamètre des taches sur les buvards (197). Il sera ainsi possible d’estimer, de manière non invasive le nombre d’UFC/ml d’urine. Les taches d’urine sont découpées, dispersées dans 10 ml de PBS pendant 30mn. Des dilutions sériées de raison 10 sont ensuite réalisées et 1ml de chaque dilution est ensemencé en gélose TS supplémenté en désoxycholate de sodium (milieu sélectif). La limite de détection est considérée à 10 UFC par échantillon.

Parallèlement à chaque temps d’analyse - J1, J3, J7, J14- 3 souris inoculées avec la même souche de chaque groupe sont prélevées :

- les urines prélevées par sondage avec expression digitale) pour dénombrement des UFC d’E.coli /ml. Les échantillons d’urine sont directement dilués au 1/100 et des dilutions de raison 10 sont ensuite réalisées, 1ml de chaque dilution étant ensemencé en milieu sélectif (gélose TS + désoxycholate de sodium). La limite de détection est considérée à 10 UFC/ml. - les vessies sont collectées pour dénombrement des UFC/vessie (essai 1). Elles sont rincées par du PBS, broyées au Potter et diluées directement au 1/100 ; des dilutions de raison 10 sont ensuite réalisées, 1ml de la dilution est ensemencé en milieu sélectif (gélose TS + désoxycholate de sodium). La limite de détection est considérée à 100 UFC/vessie.

Trois souris de chaque groupe ont leur vessie prélevée à des fins d’analyse histo- morphométrique (essai 2).

b) Histologie

Chaque vessie a été vidée puis distendue par 50 microlitres d’une solution de paraformaldéhyde dans du PBS (5%), fixation dans du liquide de Bouin (formol 5%), coloration au trichrome de Masson, et analysée par microscopie optique, en délimitant la même zone d’analyse.

c) Impact de l’inoculum sur la phase d’adhésion (T4h)

Traitement des souris

40 souris femelles C-57Bl6 de 8 semaines ont été utilisées.

La souche bactérienne étudiée est E.coli UTI89, telle qu’obtenue à l’issue de deux subcultures (2X24h) en l’absence de C102.

- 4 groupes de 10 souris, instillation de 50 microlitres de suspension d’E.coli ajustée à environ 2.108/ml, 2.107/ml, 2.106/ml et 2.105/ml.

- Quatre heures (T4h) après l’inoculation, les vessies sont prélevées après distension par 50microlitres de paraformaldéhyde à 5%, pour numération des UFC (9 souris/inoculum ; limite de détection 100ufc/vessie) et histologie (1 souris/inoculum).

Dénombrement des UFC

Les vessies prélevées et rinçées par du PBS sont broyées au Potter et diluées directement au 1/100 (1 vessie dans 10 ml de PBS). Des dilutions de série 10 sont ensuite réalisées et 1 ml de chaque dilution est ensemencé en gélose TS supplémenté en désoxycholate de sodium. La limite de détection est considérée à 100 UFC/vessie.

3.2.2.2 Effet sur l’adhésion à l’urothélium de souris inoculées avec E.coli UTI89, pré- incubée ou non avec C102

L’objectif est de savoir si in vivo C102 agit plutôt très précocement, dès l’adhésion (T4h) ou plutôt sur la colonisation, à des temps intermédiaires (J3).

Pré-incubation de la souche

La souche d’E.coli UTI89 a été entretenue sur milieu TS. Dix subcultures de 24 heures en milieu liquide, en présence du composé C102 à 1% (P/V), et en absence (culture témoin) on été réalisées.

Avant essai, les bactéries sont récupérées et lavées au PBS. Les suspensions finales sont ajustées par mesure au spectrophotomètre (640nm) à environ 2.108 UFC/ml.

La capacité d’adhésion de la souche UTI89 aux cellules vésicales in vitro (pré-incubées ou non) a été contrôlée le jour de l’inoculation. L’activité d’adhésion d’UTI89 a également été contrôlée in vitro (ex vivo) sur les bactéries isolées à partir des broyats de vessies.

Essai 4h

50 souris femelles C-57Bl6 de 8 semaines ont été utilisées, en suivant le protocole général : Gr. 1x20 souris inoculées avec 50 µl 2 .108 de la suspension de E. coli UTI89 ayant subi 10 subcultures en milieu TS en présence de C102 (Gr1)

Gr. 2x20 souris inoculées avec 50 µl 107 de la suspension de E. coli UTI89 ayant subi 10 subcultures en milieu TS en l’absence de C102 à 1% (Gr 2)

Gr. 3x10 souris témoins inoculées avec 50 µl de bouillon de culture stérile.

Les souris sont placées par groupe de 5 en cage métabolique.

Trois heures et 15 minutes après l’inoculation (restriction hydrique), les souris sont anesthésiées (anesthésie gazeuse) et subissent un cathétérisme vésical avec expression digitale

(vidange vésicale) suivie d’un rinçage. Les vessies sont prélevées après distension (euthanasie par injection intrapéritonéale de lidocaïne 1%, prélèvement vésical par laparotomie médiane). Dénombrement des UFC : Les vessies prélevées et rinçées par du PBS sont broyées au Potter et diluées directement au 1/100 (1 vessie pour 10 ml de PBS). Des dilutions séries de raison 10 sont ensuite réalisées et 1ml de chaque dilution est ensemencé en gélose TS supplémenté en Désoxycholate de sodium. La limite détection est considérée à 100 UFC/vessie.

Essai J3

Les vessies sont prélevées : numération des UFC/vessie (8 souris témoin et 16 souris/inoculum) et histologie (2 souris témoin et 4 souris/inoculum).

Conditions réglementaires des essais chez l’animal

- Certificat d’autorisation d’expérimenter sur animaux vivants n° 311155550 du 31 mai 2011

- Animalerie agréée (renouvellement de l’agrément D3155507, en date du 18 juin 2015) - Avis du comité d’éthique US006 CREFRE.