Définition des conditions expérimentales : Inoculation de différentes souches

4.2.1.1 Cinétiques de l’excrétion urinaire et persistance tissulaire

Les résultats sont présentés sous forme de cinétiques microbiennes dans urines et dans les broyats de vessies.

Le tableau 13 correspond à une cotation interprétative des différentes cinétiques observées dans les urines et les vessies aux différents temps d’observation (J1, J3, J7 et J14), pour

chacune des 5 souches d’E.coli (ABU83973, UTI89, MG1655, GGB1561 et CFT073), inoculées. Un contrôle de stérilité des urines a été fait à J0 avant inoculation de chacun des cinq groupes.

Tableau 13. Dénombrement de E.coli dans les urines et les broyats de vessies de souris

J1 J3 J7 J14 E.coli V U V U V U V U UTI89 +++ +++ +++ ++ ++ 0 + 0 ABU83972 0 0 0 0 0 0 0 0 CFT073 + à ++ ++ +++ ++ 0 0 0 0 MG1655 + à ++ + + 0 0 0 0 0 GGB1561 + à ++ + + + +/- 0 + 0

J1, J3, J7 et J14 après inoculation (V=vessie broyée ; U=urines), n=3 souris pour chaque souche d'E.coli et pour chaque temps. Zéro: ≤ 2 log. (+): entre 2 et 3 log. (++): entre 3 et 4 log. (+++): ≥ 4 log.

La figure 23A représente le pourcentage d’adhésion d’E.coli UTI89 4 heures après inoculation de l’animal. La figure 23B représente le nombre de bactéries récupérées dans les vessies des souris sacrifiées au cours des 14 jours suivant l’inoculation d’UTI89.

Figure 23. Dénombrements bactériens (UTI89) dans la paroi vésicale. A: pourcentage d’adhésion de l’inoculum 4h après l’instillation (moyenne±DS, n=16). B: nombre d’UFC récupérées dans les broyats de vessies à J1 (n=5), J3 (n=4), J7 (n=3) et J14 (n=2) après l’instillation initiale (Moyenne±DS)

Sur la base de ces résultats, des essais complémentaires ont été réalisés sur la phase initiale d’adhésion d’E.coli à la paroi vésicale.

Par ailleurs, cliniquement :

- à J1, les animaux sont tous vifs, en bonne santé.

- à J3, une souris est morte parmi celles inoculées avec UTI 89 ; tous les animaux inoculés avec les souches « virulentes » sont moins vifs que ceux inoculés avec la souche témoin ABU83972. Macroscopiquement, les vessies inoculées avec CFT073 et dans une moindre mesure par GGB1561 sont plus rouges et richement vascularisées que les vessies inoculées avec les autres souches.

- à J7, les souris restantes sont toutes surexcitées et pollakiuriques, la surface urinée horaire (buvards) a triplé entre J1 et J7, alors que les souris témoins ont des volumes urinaires comparables à ceux des autres souris avant inoculation.

- à J14, les animaux ont tous un comportement redevenu normal

Le contrôle des urines des 5 groupes à J0, fait avant inoculation, retrouve des urines stériles, pour l’ensemble des échantillons, résultat en faveur d’une technique de sondage maîtrisée. 4.2.1.2 Histologie

Les observations histologiques ont été réalisées sur les mêmes séries d’expériences.

Les caractéristiques histologiques d’une vessie de souris normale, instillée avec le milieu de culture stérile sont reconnaissables sur la figure 24. Nous y indiquons la zone retenue pour procéder aux mesures de l’épaisseur des parois vésicales (fig 24 A). Cette vessie présente côté lumière vésicale des cellules en ombrelle, tapissées par un glycocalyx en fine brosse, le nombre de couches cellulaires sous-jacentes est au plus de 4 à 6, il n’existe pas d’infiltrat cellulaire ni d'hyper-vascularisation (fig 24 B et C).

A B

C

Nous avons constaté chez l’animal inoculé avec E.coli UTI89 :

- les modifications histologiques des vessies inoculées avec UTI89 « native », non pré- incubée. De nombreux signes d’inflammation de la muqueuse vésicale sont visibles, la muqueuse est oedématiée, épaissie, le nombre de couches cellulaires de l’épithélium est augmenté. Nous n’avons pas observé de zones de nécrose, mais par endroits perte du glycocalyx et surtout un infiltrat cellulaire diffus avec une hypervascularisation, soit des grades 1 et 2, selon la gradation histo-pathologique proposée par Hopkins(175), correspondant bien au mode de réponse déjà décrit pour la souche murine C57BL/6, se caractérisant par :

- une résolution progressive de l’IU induite, de façon linéaire, (CFU/mg de vessie)

- une réponse inflammatoire vésicale initiale modérée, de grade 1 à 2, décroissant avec le temps et parallèlement à la diminution des CFU, la réponse inflammatoire la plus intense intervient entre le 1er et le 3ème jour après l’inoculation.

Figure 24 : aspect histologique normal de vessie de souris

- Présence de glycocalyx

- Cellules en ombrelle, matures, en surface

- Nombre de couches cellulaires sous- jacentes <4,

- Vaisseaux peu nombreux dans la musculeuse, sans signes d’inflammation (dilatation ou afflux de polynucléaires)

1.25X 10X

4.2.1.3 Impact de la taille de l’inoculum d’UTI89 sur l’adhésionvésicale à T4 heures

Afin de finaliser le choix des conditions expérimentales, nous avons également évalué l’impact de la taille de l’inoculum sur la phase d’adhésion (numération des UFC d’E.coli UTI89 au niveau de la vessie, 4 heures après inoculation).

Tableau 14.Impact de l’inoculum initial sur la colonisation à 4 heures

Inoculum initial

(UFC) 10 4 10 5 10 6 10 7

Moy Log UFC ± DS dans les vessies

_ 3,07 +/- 0,96 4,13+/- 1,41 4,49 +/- 0,50

Moyennes des log du nombre de bactéries récupérées (UFC/ml) pour chaque groupe de 9 souris (moy± DS), en fonction de l’inoculum initial (UFC/ml).

Le tableau 14 présente les logarithmes des UFC obtenues en fonction de l’inoculum initial. En faisant varier l’inoculum bactérien de 104 à 107 UFC/ml nous constatons que l’adhésion d’E.coli UTI89 à la muqueuse vésicale est proportionnelle à l’inoculum initial, avec:

- une absence de bactéries détectables à 4h pour des inoculi inférieurs ou égaux à 104 UFC/ml

- une détection d’E.coli chez toutes les souris dès 105 UFC/ml

- un taux d’adhésion croissant pour atteindre plus de 4 log en moyenne à partir de 106 UFC/ml

- une colonisation relativement homogène sur l’ensemble des animaux pour un inoculum à 107 UFC

Les observations conduisent à conclure que:

- UTI 89 est la souche qui persiste le plus longtemps, sa sélection pour évaluer l’effet du

composé d’intérêt est ainsi confortée ;

- la poursuite de temps de contact au-delà de J3 semble inutile, les bactéries ne

s’installent pas et la guérison (non détection de E. coli et disparition de la réponse inflammatoire) est obtenue spontanément entre J7 et J14 sur ce modèle murin

- l’urine n’est pas le meilleur reflet de l’inoculum colonisant, les dénombrements d’UFC

/ml d’urines sont abandonnés au bénéfice des UFC sur vessie, plus sensibles.

- sur la base de la littérature(173) et de notre observation sur l’impact de l’inoculum sur la

colonisation, les conditions d’inoculation choisies pour les essais ultérieurs sont 50µl de