Etude fonctionnelle de la mobilité bactérienne

Les premiers essais de mobilité fonctionnelle d’E. coli UTI89 ont été réalisés en ensemençant les géloses molles, adaptées à chacun des trois types de mobilité, « twitching », « swimming » et « swarming », avec les bactéries obtenues après 10 subcultures en présence ou non de C102 1%.

Les résultats sont présentés ci-dessous (Figure 16): nous constatons qu’il existe une différence de diffusion significative entre les bactéries pré-incubées ou non en présence de C102, 48 heures après le dépôt sur la gélose sur les milieux « twitching » (mouvements à type de reptations, en lien avec les pili de type IV) et « swarming ». Le swarming repose sur des rotations très rapides du flagelle, de plusieurs cellules bactériennnes en "rafts" à la surface d’un milieu solide vers un objectif. La mobilité de type swimming, également liée au flagelle, concerne la bactérie individuellement et en milieu planctonique ; elle n’est pas impactée de façon significative.

Figure 16. Surfaces des culture bactérienne en cm2 après 10 subcultures en présence de C102 à 1% (P/V) (en rouge) et en l’absence (en bleu) mesurées à 48h sur gélose molle de composition adaptée à l’étude de chacun des types de mobilité « twitchning », « swimming » et « swarming », (moyenne ± DS; n=27, test de rang de Mann & Whitney).

Afin de conforter les résultats du transcriptome par l’impact sur la fonction, nous avons choisi d’approfondir l’étude du « swarming », en mesurant les aires de colonies observées 8 heures, 24 heures et 48 heures après ensemencement de géloses « swarming » contenant ou non C102

à 1% ou 0,1% (P/V) avec des E.coli UTI89 obtenus après 10 subcultures en présence ou non de C102 à 1% (P/V) (5 géloses par condition) (Figure 17).

Figure 17. Surfaces des colonies, en mm2, observées à 8h (A), 24h (B) et 48h (C), selon six conditions d’exposition ou non à C102: a) subcultures et gélose sans C102 b) subcultures sans C102, gélose avec C102 0,1% (P/V)c) subcultures sans C102 gélose avec C102 1% (P/V) d) subcultures C102 1% (P/V) et gélose sans C102 e) subcultures C102 1% (P/V) et gélose avec C102 0,1% (P/V) f) subcultures C102 1% (P/V) et gélose avec C102 1% (P/V) (moyenne ± DS; n=5).

Dans chaque graphique de la figure 17, les différences observées pour la même condition de culture (bouillon) selon différentes condition de gélose (0%; 0,1%, 1% de C102 P/V) sont statistiquement significatives (p=0,008, test de rang de Mann & Whitney). La pré-incubation avec C102 se traduit par une moindre surface de la culture dans tous les cas où la culture se fait elle-même en présence de C102. Cet effet est dose-dépendant puisque nous constatons une limitation de la diffusion de la colonie quand la gélose comporte de la canneberge, avec une moindre inhibition pour la gélose à 0,1% par rapport à celle à 1% C102 (P/V). En revanche, lorsque UTI89 a été pré-incubé en présence de C102, mais que la culture est faite sur une gélose ne contenant pas de C102 nous observons un "excès" de surface, en faveur d'un effet "rebond".

Ces observations ont été confirmées lors d’une seconde série d’essais réalisée avec UTI89 ayant subi 10 subcultures en absence ou présence de C102 à 1% P/V et ensemencement sur gélose « swarming » contenant ou non du C102 à 1% P/V. Pour cet essai, 15 réplicats ont été réalisés avec prise d’images.

Les images (figure 18) présentent une série de géloses "swarming" prises au hasard parmi les 15 séries de 4 boîtes numérotées. Les 4 boîtes correspondent à 4 conditions différentes, selon que les subcultures ont été faites ou non en présence de C102 1% (P/V) et que les géloses ensemencées contenaient ou non du C102 1% (P/V). Les images des 14 autres séries de boîtes sont superposables.

Figure 18. Swarming : Condition 1 : subcultures témoin & gélose témoin. Condition 2 : subcultures témoin & gélose avec C102 (1%). Condition 3 : subcultures en présence de C102 (1%) & gélose témoin. Condition 4 : subcultures en présence de C102 (1%) & gélose avec C102 (1%). Lecture à: T8h, T24h et T48h.

Figure 19. Surfaces des cultures d’UTI89 (mm2) mesurées à A : 8 heures, B : 24 heures et C : 48 heures, sur les boîtes de gélose « swarming », selon les différentes conditions d’exposition ou non de C102 (1%). a) subcultures témoin & gélose témoin. b) subcultures témoin & gélose avec C102 1% (P/V). c) subcultures en présence de C102 1% (P/V) & gélose témoin. d) subcultures en présence de C102 1% (P/V) & gélose avec C102 1% (P/V), (moyenne ± SD ; n=15, p<0,0001, test de rang de Mann&Whitney).

Les surfaces de recouvrement des colonies ont été mesurées aux 3 temps, 8, 24 et 48 heures pour les 15 boîtes de culture correspondant à chacune des 4 conditions. (Figure 19). Dans chaque graphique les différences observées pour la même condition de culture (bouillon) selon différentes condition de gélose (0% et 1% de C102 P/V) sont très hautement significatives (p<0,0001, test de rang de Mann & Whitney).

Ainsi, sur gélose comportant du C102 (sans notion de subcultures en présence de C102) (figures 17 et 19 en bleu; figure 18, conditions 2 et 4), on note une inhibition de la diffusion des bactéries à partir du spot d’inoculation.

Dans le cas où 10 subcultures sur C102 ont été réalisées avant dépôt sur gélose avec C102, la présence de C102 dans la gélose maintient l’effet inhibiteur du phénomène de swarming (figure 18: condition 4).

En revanche, dans le cas où 10 subcultures sur C102 ont été réalisées avant dépôt sur gélose sans C102 (figure 17: en rouge; figure 18: condition 3), on observe un développement important de la colonie, développement fonction de la durée d’incubation. Ces résultats démontrent l’effet réversible déjà observé (tests d’adhésion aux cellules T24), mais au-delà de cette observation, les bactéries diffusent rapidement sur les géloses sans C102 avec à nouveau un avantage apparent pour celles préalablement cultivées en présence de canneberge.

Au total

Les essais réalisés avec subcultures des bactéries en présence ou non de C102 et sur géloses molles sans C102 ne montrent pas de réduction significative de la mobilité quelle qu’elle soit. En revanche, la présence de C102 dans le milieu gélosé test se traduit par une réduction significative des diamètres de croissance et donc des surfaces colonisées. Ce phénomène est observé que les bactéries aient été ou non prélablement incubées en présence de C102.

L’effet inhibiteur du swarming nécessite donc un contact permanent avec C102, il s’épuise lorsque la bactérie n’est plus en contact avec C102 (multiplication bactérienne en absence de C102). L’absence d’effet observé sur gélose sans C102, malgrè les 10 subcultures en présence de C102 pourrait être lié au nombre important de générations lors de la réalisation du test permettant la réversibilité des effets (adhésion aux cellules T24) et des modifications d’expression géniques observées.