I.5. Le principe des SMR/SNR
I.5.3. Exemple d’applications développées à l’aide de SMR/SNR
La première méthode a permis de mesurer la masse et le volume de plusieurs échantillons de cellules. Cel l bu o y a nt m as s 𝑚 𝐵 Fluid density 𝜌𝑓𝑙𝑢𝑖𝑑 𝒀 = 𝒎𝒄𝒆𝒍𝒍− 𝑽𝒄𝒆𝒍𝒍 ∙ 𝑿 𝝆𝒇𝒍𝒖𝒊𝒅 𝟏 < 𝝆𝒄𝒆𝒍𝒍 𝝆𝒇𝒍𝒖𝒊𝒅 𝟐 > 𝝆𝒄𝒆𝒍𝒍 𝑚𝑐𝑒𝑙𝑙 𝜌𝑐𝑒𝑙𝑙 𝑉𝑐𝑒𝑙𝑙
Figure 42 – Principe de la détection des masse et densité d'une cellule en utilisant deux fluides de densité différente. Les deux valeurs de masse flottante relevées permettent de tracer une courbe dont l’ordonnée à l’origine correspond à la masse de la cellule et la pente correspond à son volume.
(a)
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En effet, en réalisant la pesée dans deux fluides de densité différente, on peut tracer une courbe linéaire sur laquelle il devient possible de lire le volume et la densité de la particule d’intérêt, avec un débit de mesure de 500 cellules par heure [104].
En travaillant sur ce principe, il a également été possible de distinguer les masses et densités sèches et aqueuses de plusieurs types cellulaires [102], informations qui jusque-là n’étaient pas accessibles à l’aide de techniques classiques. En sélectionnant trois fluides (Percoll3, eau H
2O, eau lourde D2O) présentant des densités adaptées, l’équipe de Manalis a ainsi pu distinguer la masse sèche d’une cellule de sa masse aqueuse.
Figure 43 – Trois solutions utilisées pour la mesure des masses et densités sèches et aqueuses de cellules et bactéries [102].
Le Percoll a notamment été utilisé étant donné que, contrairement à l’eau et à l’eau lourde D2O, il ne va pas remplacer le liquide intracellulaire et va rester hors de la cellule ; il comporte en outre la même densité que l’eau lourde utilisée, ce qui permet de déduire à l’aide de ces deux mesures la masse flottante provenant uniquement du matériel aqueux de la cellule.
La différence entre les expériences menées dans l’eau ou le D2O va permettre de déterminer à la fois la masse et la densité globales de la cellule. On peut en déduire les masse et densité du matériel cellulaire non aqueux. La Figure 44 détaille le protocole de mesure mis en œuvre. Le principe de mesure a également été adapté à l’étude de phénomènes évolutifs tels que la croissance cellulaire de souches diverses.
3 Solution colloïdale peu visqueuse, possédant une faible osmolarité et ne présentant pas de toxicité spécifique pour les cellules,
souvent utilisée pour la mise en place de gradients de densité. Marque déposée par GE Healthcare.
- Les solutions𝑃𝑒𝑟𝑐𝑜𝑙𝑙 et 𝐻2𝑂sont utilisées pour
mesurer les masse et densité totales.
- Les solutions 𝐻2𝑂 et 𝐷2𝑂 sont utilisées pour
mesurer les masse et densité sèches.
- La différence entre les masses flottantes mesurées dans le 𝑃𝑒𝑟𝑐𝑜𝑙𝑙 et dans 𝐷2𝑂 permet
d’évaluer les propriétés du matériel intracellulaire aqueux.
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Figure 44 – Principe de mesure des masses et densités, sèches et aqueuses, de cellules et bactéries. Trois fluides porteurs différents sont utilisés; les différentes masses flottantes mesurées permettent d'évaluer graphiquement les paramètres d'intérêt.
Cependant, l’influence du principe de mesure sur le comportement des cellules caractérisées n’est pas négligeable ; si le piégeage en bout de cantilever ne permet pas des conditions de viabilité idéales, on peut également noter que la pression fluidique exercée sur la cellule affecte la taille de cette dernière et vient fausser en partie les résultats.
Outre les propriétés « volumiques », d’autres caractéristiques des cellules peuvent être étudiées en adaptant la géométrie du canal suspendu. En effet, nous avons vu qu’il était possible de monitorer la position d’une particule en suivant le décalage en fréquence mesuré (la particule est à l’apex lorsque le décalage est maximal). Or, si une cellule rencontre un obstacle type constriction fluidique la forçant à se déformer et à frotter contre les parois, sa vitesse de transit dépend de ses propriétés de surface et de déformabilité. Ainsi, en ajoutant un tel obstacle dans le canal, il devient possible de mesurer à la fois la densité, la déformabilité et la taille des cellules, et de corréler les trois grandeurs mesurées. Ce principe a été exploité par Manalis et son équipe pour différencier des souches de cellules tumorales circulantes (plus déformables, moins rugueuses) de souches saines [106].
I.5.3.2. Détection de nanoparticules – SNR
I.5.3.2.1. Difficultés liées aux dimensions nanométriques des SNR
Des cantilevers à échelle plus réduite ont été développés pour la détection de masses plus faibles ; c’est l’avènement des systèmes SNR. Cependant, si elle permet de travailler à de plus hautes fréquences, cette réduction d’échelle comporte aussi ses inconvénients [51], [96] :
𝑯𝟐𝑶 𝑷𝒆𝒓𝒄𝒐𝒍𝒍 𝑫𝟐𝑶 Densité fluide 𝜌𝑓𝑙𝑢𝑖𝑑 𝝆𝒅𝒓𝒚 𝒎𝒅𝒓𝒚 Masse flottante de l’eau intracellulaire Ma s s e f lott a nte 𝑚𝐵 𝝆𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒎𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 Mas s e f lot ta n te c e llu le 𝑚 𝐵 Densité fluide 𝜌𝑓𝑙𝑢𝑖𝑑 1
Etude des masse et densité totales 2 Etude des masse et densité sèches
Ma s s e f lott a nte 𝑚𝐵 Densité fluide 𝜌𝑓𝑙𝑢𝑖𝑑
71 o réduction du rapport signal sur bruit
o dégradation du facteur de qualité
o réduction de la qualité de la fabrication, qui repose en grande partie sur des étapes photolithographiques qui s’avèrent d’autant plus complexes que la taille des objets à définir diminue
Ainsi, d’autres méthodes d’analyses du signal ont été implémentées dans le système complet, permettant d’extraire d’autres informations. C’est le travail que mènent depuis 2012 Olcum, Knudsen et Cermak au sein de l’équipe de Manalis. A l’aide de ces améliorations, il a notamment été possible de détecter des nanoparticules d’or de diamètre 10 nm ainsi que des virus isolés [96], [107].
I.5.3.2.2. Analyses multimodales
D’autres développements ont été réalisés dans le but de réduire encore la résolution massique de ces systèmes. En 2011, l’équipe de Manalis avec Jungchul Lee s’intéresse à des modes de vibration supérieurs au fondamental afin d’en voir les effets sur la mesure [108]. Il s’avère alors que l’incertitude sur la mesure de masse est jusqu’à deux fois plus faible avec le second mode de flexion (0,27% au lieu de 0,49%) ; l’histogramme obtenu à partir des résultats est ainsi plus fin et plus précis. En 2015, cette idée d’exploiter plusieurs modes a fait son chemin, et le MIT présente un travail de détection / pesée de particules en excitant 4 modes à la fois [100]. Cette étude repose sur l’utilisation d’une poutre de 200 µm de long et 2 µm de large, actionnée à l’aide de piézocéramiques, ainsi qu’un mode de détection optique.
Figure 45 – Résultats des mesures effectuées sur des particules d’or de différentes tailles [100]. (a) Décalages en fréquence mesurés lors du passage de particules. (b) Détermination de la position des particules dans le canal en fonction du temps. (c) Explication du retard dû aux forces centrifuges exercées à l'apex du cantilever.
En faisant appel à plusieurs modes, il est possible de connaître avec précision non seulement la masse d’une particule en transit (incertitude de 41 ag) mais également sa position (incertitude de 37 nm au niveau de l’apex de la poutre). En effet, dans un canal en « U » comme c’est le cas ici,
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une force centrifuge s’applique sur les particules, qui présente une amplitude différente en fonction de leur taille. Ainsi, les particules les plus lourdes, poussées vers la paroi externe du canal, présentent un temps de passage plus long ; en regardant la largeur du pic de résonance, on peut en déduire la position latérale de la particule dans le canal.
Un des principaux inconvénients de cette méthode est de mettre en place les outils nécessaires à la détection simultanée de 4 modes ; en effet, ce système nécessite plusieurs boucles de rétroaction en parallèle et donc un système complet particulièrement rapide, robuste et donc onéreux.
I.5.3.3. Dispositif créé au MIT et commercialisé par Malvern Instruments
Les premiers développements ont donné lieu à la commercialisation d’un biocapteur baptisé Archimedes®, rapidement racheté par le géant de la métrologie Malvern.
Le dispositif a été utilisé par plusieurs équipes pour la détection de particules en fluide ; les articles de Nejadnik et al. [109] ainsi que Folzer et al. [110] décrivent respectivement l’analyse de la densité de colloïdes protéiques, ou bien la détection de la masse de BSA adsorbée sur des microbilles de polystyrène.
Cependant, si les progrès apportés par la technique ont permis d’améliorer sans cesse la fabrication, seuls quelques changements [111] ont été opérés afin de réduire les coûts de fabrication. En effet, descendre si bas en résolution massique implique toujours de réaliser un packaging sous vide du cantilever au sein de la puce, ce qui accroît à la fois la complexité de cette technologie ainsi que son coût.