Matériel et méthodes
IV- 3-2-1-Evaluation enzymologique :
La mesure de l’activité inhibitrice des propolis d’El-Malha (P1) et de Benibelaid (P2) est basée sur le principe de transfert d’énergie par résonance RET ou encore transfert d’énergie de fluorescence par résonance FRET (figure-16). Le substrat est constitué d’un oligopeptide comportant un groupement fluorescent (F), donneur d’énergie et un groupement éteignant (Q, pour quenching), accepteur d’énergie. Après hydrolyse, le groupement éteignant est libéré, permettant de mesurer l’augmentation de fluorescence (Huet 2001). De nombreux couples fluorescent/ éteignant ont été développés pour la mesure de l’activité enzymatique des MMPs dont le couple 7-méthoxycoumarine-4-acétyl (Mca) / dinitrophenyl-diamonopropionyl (Dnp) (Knight 1991 et 1992).
Figure-16: Représentation schématique de la mesure de l’activité enzymatique basée sur le principe d’extinction intramoléculaire.
IV-3-2-2-Mise au point de la mesure de l’effet inhibiteur des propolis sur l’activité enzymatique des MMPs à l’aide d’un spectrofluorimètre lecteur de plaque :
Principe :
Une enzyme est une protéine capable de catalyser spécifiquement la transformation d’un ou deux substrats. En prenant un modèle simplifié de réaction enzymatique :
S P, la vitesse de réaction s’écrit : v = d (P) / d (T)=- d (S) / d (T).
Pour tracer une courbe P=f (T), l’enzyme E agit sur le substrat S ; le temps zéro correspond au déclenchement de la réaction. L’apparition du produit P est mesurée en fonction du temps (figure-17).
Figure-17: Courbe P= f (T), relation entre l’apparition du produit et le temps.
La vitesse de réaction v = d (P) / d (T) est constante pendant les conditions initiales (partie de courbe OA). Pour cette portion de la courbe, la tangente à l’origine se confond avec la courbe : la vitesse, pente de la tangente OA, est appelée vitesse initiale. Puis la vitesse diminue (portion de courbe AB) est s’annule (portion BC). La vitesse s’annule lorsque l’un des substrats est consommé ou lorsqu’un équilibre s’établit. Lorsque la vitesse d’une réaction enzymatique est déterminée, c’est toujours la vitesse initiale qui est calculée. Les mesures de vitesse sont donc faites dans les conditions initiales ou moins de 10% de la quantité du substrat est hydrolysé. Cette vitesse est proportionnelle à la concentration de l’enzyme : elle traduit donc l’activité d’une préparation de l’enzyme exprimée en unités enzymatiques. L’unité internationale (UI ou U) représente la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par minute.
Technique d’évaluation : Activation des MMPs :
Les métalloprotéinases sont synthétisées sous forme de zymogènes inactifs.
L’activation de ces pro-MMPs représente l’étape clé de la régulation de l’activité des MMPs. Elle résulte de la perte de complexation entre le soufre d’une cystéine du pro-domaine et du zinc du site catalytique. Cette activation peut se faire physiologiquement soit dans le milieu extracellulaire, soit à la surface cellulaire ou encore dans le cytoplasme.
La procédure expérimentale nécessite donc l’activation des pro-enzymes sur lesquelles l’effet de la propolis sera testé. Ces dernières sont activées par le biais de l’APMA (4-aminophenylmercuriacetate) dissoute dans la soude (NaOH à 0,1N). La concentration finale de l’APMA dans la solution est de 10 ou 20 mmol/L selon la pro-enzyme activée.
L’activation est réalisée comme suit : pour 1µl de pro-enzyme, on ajoute 0,8 µl de solution d’APMA et 6,2 µl de tampon tritest. La solution ainsi obtenue est incubée au bain marie, à 37°C pendant 1 ou 2 heures en fonction de la nature de la pro-enzyme à activer.
Le substrat (solution) est conservé à + 4°C à l’abri de la lumière. Ces substrats sont très insolubles et doivent donc être dissous dans des solvants organiques tels que le dimethylsulfoxide (DMSO). Toutefois la quantité finale de solvant dans l’essai doit être inférieure à 1% de manière à éviter tout risque de dénaturation de l’enzyme ou de modification de ses conditions.
Préparation et lecture des plaques :
Les échantillons de propolis sont testés pour un éventuel effet inhibiteur de l’activité des MMPs. Le test est réalisé sur des microplaques noires clinitest de 96 puits dont les sites de liaison non spécifique ont été boqués à l’aide d’une solution de sérum albumine bovine (SAB) à 0,1% (P / V) dans un tampon tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5mM PH 7,5. Les propolis P1 et P2 sont testées aux concentrations allant de 10-6 à 10-10 g/ml (dans le DMSO). La quantité de propolis déposée par puits est 2 µl dans un volume total de 200 µl. Ce volume comprend l’échantillon testé (propolis), un tampon (généralement tritest), l’enzyme et le substrat correspondant. Ces deux derniers varient en fonction de l’enzyme testée (tableau-16). Tous les essais sont effectués en triple et des puits blancs et témoins sont intégrés aux microplaques. Les puits blancs contenants les solutions tampon et substrat permettent de vérifier l’absence d’une activité enzymatique. Les puits témoins qui contiennent l’enzyme étudiée en plus des solutions citées précédemment permettent de démontrer que l’activation de l’enzyme est correcte en absence de l’inhibiteur à tester.
Tableau-16 : Paramètres à respecter dans la préparation et la lecture des microplaques en fonction des enzymes étudiées.
Enzyme T° réaction Filtre excitation Filtre émission Gain Qté E/ puit Substrat Tampon Pro-MMP-2 T° ambiante 326 nm 465 nm 180 10 ng M1895 2 µmol / L Tritest MMP-3 cat 37 °C 360 nm 465 nm 100 0,005 µmol / L S2300 1 µmol / L TCZ MMP-7 T° ambiante 326 nm 465 nm 180 20 ng M1895 2 µmol / L Tritest Pro-MMP-9 T° ambiante 360 nm 465 nm 140 5 ng M1895 10 µmol / L Tritest MMP-14 T° ambiante 326 nm 465 nm 180 12,5 ng M1895 2 µmol / L Tritest Plasmine T° ambiante - 405 nm - 0,2 µg S2231 0,3 mM Tris HCl Elastase leucocytaire - 405 nm - 8 nM Mcosuc (Ala)2 1mM Tris HCl
La fluorescence des puits de la microplaque est mesurée sur un lecteur de plaque HT Soft 7000 + (Perkin Elmer), aux longueurs d’ondes d’excitation et longueurs d’ondes d’émission précisées dans le tableau-18 durant 20 ou 30 minutes.
Les résultats fournis par le lecteur correspondent aux variations de fluorescence enregistrées, dépendantes de la quantité de substrat consommé par l’enzyme étudiée, et qui variera donc en fonction de la concentration de l’inhibiteur (propolis) présente dans chaque puits. Avec l’utilisation du logiciel Excel, les moyennes des données pour chaque temps de mesure sont réalisées. Par la suite, les courbes de la variation de fluorescence en fonction du temps pour chaque concentration de propolis sont tracées. La pente de ces courbes est alors comparée à la pente de la courbe reflétant l’évolution de la fluorescence de la solution témoin. Le rapport Vi / V0 est ainsi obtenu. Ces données permettront de déterminer par analyse de régression non linéaire les IC50 et éventuellement les Ki grâce au logiciel Grift Computer Software.
En plus de leur effet sur l’activité des MMPs, les propolis P1 et P2 sont testées pour un éventuel effet inhibiteur de l’activité de la plasmine et de l’élastase leucocytaire. La technique utilisée est semblable à celle des MMPs à l’exception des plaques (plaque transparente clinitest de 96 puits), du filtre (excitation et émission) et du gain. Les activités enzymatiques de la plasmine et de l’élastase leucocytaire sont mesurées par l’hydrolyse des substrats spécifiques S2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA) (pNA, para-nitoanilide) et N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-pNA. La cinétique de libération du para-nitroaniline est suivie par mesure de l’absorbance à 405 nm.
IV-3-3-Influence de la propolis sur l’activation de la pro-MMP-3 par la plasmine