Matériel et méthodes
IV- 3-3-1-2- Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium : sulfate de sodium :
Les protéines sont séparées en fonction de leur masse moléculaire apparente par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium PAGE-SDS selon la méthode décrite par Laemmli 1979. Les échantillons sont mis en suspension dans du tampon échantillon (Tris-HCl 0,375 M, SDS 0,1% (P/V), APS 0,05% (P/V), TEMED 0,05% (V/V) PH 8,8). Le gel est alors soumis à un courant de 10 mA pendant 30 minutes puis de 20 mA pendant 90 minutes (tampon de migration : Tris 25 mM, SDS 0,1% (P/V), glycine 192 mM PH 8,3).
Electrotransfert et immuno-révélation des protéines :
La révélation des protéines en PAGE-SDS est réalisée par la technique de Western blot selon les techniques décrites par Towbin et al 1979.
Après migration, le gel est équilibré pendant 30 minutes dans un tampon de transfert (Tris HCl 48 mM, glycine 39 mM, méthanol 20%, SDS 1,3 mM, qsp 1L d’eau distillée). Dans le même temps, la membrane de PVDF (difluore de polyvinyl) est activée 15 secondes dans le méthanol, réhydratée pendant 5 minutes dans l’eau distillée puis équilibrée dans le tampon de transfert. Les protéines sont ensuite transférées du gel vers la membrane PVDF pendant 45 minutes sous un voltage constant de 100 V. Afin de vérifier le transfert des protéines sur la membrane, celle-ci est trempée 15 secondes dans le méthanol afin de fixer les protéines, séchées puis colorées avec une solution de rouge ponceau.
Immunomarquage et révélation :
La membrane est réactivée 15 secondes dans le méthanol, réhydratée 5 minutes dans l’eau et rééquilibrée 10 minutes dans une solution de TBS-T PH 7,5 (Tris Buffer Saline-Tween 20 : Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M). Elle est ensuite bloquée pendant une nuit à 4°C dans une solution de TBS-T contenant 5% de SAB, afin de saturer les sites non spécifiques. Après blocage la membrane est incubée pendant 2 heures sous agitation dans une solution d’anticorps primaire (anti-MMP-3), diluée à 1/1000 dans du TBS-T 1%. Cette étape est suivie de trois lavages de 10 minutes avec du TBST, d’une incubation d’une heure avec une solution d’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (TBST-BSA 1%), et de plusieurs lavages avec les tampons TBST, puis TBS. La révélation s’effectue par autoradiographie, à l’aide d’un kit de détection chimiluminescence (ECLTM western blotting detection reagent) et de film photographique (hyperfilmTM ECL).
Figure-18: Schéma général de la révélation des protéines par chimiluminescence (Brassart 2000).
IV-3-3-2- En présence d’UV-A :
L’exposition au soleil peut induire des effets rapides et profonds sur l’organisme. On parle alors de réaction aigue. Ceci englobe la réaction inflammatoire et les événements immunologiques qui en découlent. La photosensibilité et les brûlures conduisent à la formation d’érythème et d’œdèmes. Il se produit également des effets à long terme qui ont pour conséquences le vieillissement et les cancers cutanés.
Le vieillissement photo-induit se caractérise par l’élastose, un défaut de la matrice extracellulaire du derme lié à la synthèse anormale de collagènes. Ces altérations des structures, des fonctions et de l’apparence de la peau sont dues à la libération de radicaux libres oxygénés et à la surexpression et à la suractivation des MMPs (Cauchard et Hornebeck 2004).
Le développement des sociétés et l’épanouissement des différentes populations ainsi que le développement de l’information (surtout les médias) ont permis à monsieur tout le monde de connaître les dommages de l’exposition au soleil. Cette situation à entraîner une augmentation de l’utilisation des produits anti-rides ou plus généralement anti-âges. Si
actuellement de nombreux actifs anti-âges sont commercialisés en cosmétique, aucun d’entre eux n’agit sur l’activité des MMPs.
De nombreuses études réalisées sur des fibroblastes dermiques en culture ont montré que l’irradiation UV entraîne une augmentation de l’expression des MMPs particulièrement les MMP-1 et MMP-3 (Ramos-Desimone et al 1999, Brennan et al 2003). La MMP-3 est une enzyme clé qui intervient dans l’activation d’autres MMPs comme la MMP-1 et MMP-9 à travers une cascade protéolytique (Huet et al 2004). Le but de notre travail est d’évaluer l’effet de la propolis (fraction et produits isolés) sur l’expression de la MMP-3 après exposition aux rayonnements ultraviolets (UV-A) au niveau de fibroblastes humains dermiques en culture.
• Culture des cellules :
Les cultures de fibroblastes dermiques humains sont établies à partir d’explants de biopsie d’adultes sains après avoir recueilli leur consentement (âge : 47 ans). Les FDH sont cultivés dans un milieu minimal d’Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau fœtal, 200 U/ml de pénicilline, 50 U/ml de streptomycine et 2 mM de glutamine, à 37 °C en présence de 5% (V/V) de CO2. Les FDH sont utilisés entre le 5ème et le 10ème passage.
Les FDH sont cultivés jusqu'à 80% confluence dans le DMEM contenant 10% de SVF dans des plaques de 6 puits à raison de 5. 105 cellules / puit. Les plaques sont ensuite incubées à 37°C sous atmosphère contrôlée contenant 5% (V/V) de CO2 pendant 1 nuit pour permettre l’adhésion des cellules.
• Irradiation UV :
Après confluence (24H d’incubation), le milieu de culture est éliminé. Les cultures sont ensuite rincées deux fois avec le PBS. Avant l’irradiation, les cellules sont placées dans 2 ml de PBS puis exposées à 10 J / cm2 d’UVA pendant 30 minutes à 37°C dans un appareil Vilbert Lourmat. Les cellules sont ensuite rincées deux fois avec le PBS puis incubées pendant 24 heures dans un milieu sans sérum en absence et en présence de 10 µg/ml de propolis (fraction et produits isolés). La plaque témoin, non soumise aux UV-A est traitée dans les même conditions. Les cellules sont placées dans du PBS, puis laissées sous la hotte à flux luminaire le temps de l’irradiation. Le PBS est ensuite remplacé par du milieu DMEM sans SVF. Enfin, les deux plaques sont incubées 24 heures à 37°C. Le milieu de culture est récupéré et centrifugé à 500 tours pendant 5 minutes afin d’éliminer les débris cellulaires.
Après dosage des protéines par la méthode de Bradford (Bradford 1976) l’expression de la MMP-3 au niveau des milieux conditionnés est analysée par Western blot. La méthode
de Bradford est une technique basée sur la variation de couleur du bleu de Coomassie G-250 par l’interaction à différente concentration de protéines. 10 µl d’échantillon sont mélangés avec 790 µl d’eau distillée et 200 µl de réactif Bio-Rad Protein Assay. Après agitation, les échantillons sont incubés 15 min à température ambiante. L’absorbance est mesurée à 595 nm. La concentration en protéines des différents milieux est déterminée grâce à une gamme d’étalonnage réalisée en parallèle avec de l’albumine bovine.