2.7.1 Echantillonnage
Sur les arbres en conteneur, pour chaque organe, chaque arbre et chaque traitement, une fraction est réservée pour l’évaluation de la résistance au gel. La figure m.16 montre l’échantillonnage des différents organes de l’arbre. Le nombre d’arbres à analyser étant important, les prélèvements se sont déroulés sur plusieurs jours. Les périodes de prélèvement furent les suivantes :
Automne 2004 : du 11/10/2004 au 4/11/2004. Hiver 2004-2005 : du 24/01/2005 au 16/02/2005. Automne 2005 : du 5/10/2005 au 24/10/2005. Hiver 2005-2006 : du 18/01/2006 au 6/02/2006.
) Test GélistaTM
Le test GélistaTM se fait seulement sur les rameaux. 3 tronçons de 4 cm de long ont été prélevés aléatoirement sur l’ensemble du pool ‘rameau’ et par traitement.
) Test LT50
Le test se fait sur les différents organes.
¾ Rameaux de l’année : Lors de la première année d’expérimentation et pour chaque traitement, 4 morceaux de 3 cm de long environ ont été affectés au test du LT50. La deuxième année, un cinquième segment a été incorporé pour être conditionné à une température inférieure à -50°C.
¾ Tronc : Des segments de 4 cm environ ont été sélectionnés au hasard sur toute la longueur de l’organe.
¾ Pivot : Des rondelles de 3 cm de large ont été prélevées de manière aléatoire.
¾ Grosses racines : Des segments de 7 cm environ ont été choisis au hasard dans le pool des grosses racines.
¾ Racines fines : Pour les racines fines, une quantité suffisante pour réaliser le test est prélevée de manière aléatoire dans le pool de racines fines.
Pour les arbres en verger, des segments de 5 cm (figure m.17) sont employés pour évaluer la résistance au gel des arbres en conditions naturelles. En 2004-2005, le relevé fut mensuel. En 2005-2006, il y eut trois relevés par saison (Automne : les 10, 17 et 24 octobre 2005 ; Hiver : les 23 et 30 janvier 2006 et le 6 février 2006 ; Printemps : le 27 mars 2006 et les 3 et 5 avril 2006). Mais dans ce manuscrit, nous avons choisi de ne pas présenter les
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données de printemps. Elles seront seulement utilisées pour la validation du modèle au chapitre II.
2.7.2 Traitement gel-dégel
2.7.2.1 Arbres en conteneur
Les échantillons récoltés lors du prélèvement sont placés dans des filets (figure m.20). Le refroidissement des compartiments des chambres est contrôlé par un bain-marie de type Huber Ministat (Huber Ministat cc et Huber Ministat cc3, Allemagne). Chaque chambre est programmé pour respecter une vitesse de descente en température de 5°C.h-1 qui correspond à une variation de température rapide mais compatible avec des situations enregistrées en conditions naturelles (Améglio, données non publiées). Les programmes de cycle de gel/dégel des chambres sont donnés en annexe A2. Des thermocouples cuivre-constantan sont installés à l’intérieur de la chambre, ainsi que sur les organes végétaux. Les températures sont enregistrées sur un Delta-T-Logger (cf. § 2.2.2). Les données sont scrutées toutes les minutes puis moyennées toutes les 5 minutes. Après un cycle de gel/dégel, les échantillons destinés au test LT50 sont sortis des chambres. Les segments destinés au test GélistaTM sont conservés et subissent en plus du programme n°1, le programme n°2 (annexe A2) ou plusieurs répétitions du programme n°1.
2.7.2.2 Arbres en conditions naturelles
Les échantillons de rameaux sont empaquetés dans du papier imbibé d’eau. L’ensemble est enveloppé dans du papier d’aluminium et placé dans des thermos. Les
Figure m.20 : Intérieur d’une chambre de conditionnement.
Filet contenant les échantillons destinés au test du LT50
Sonde externe (Pt100) Ventilateur pour homogénéiser la température de l’air à l’intérieur de la chambre Tuyau en cuivre permettant la circulation du liquide de refroidissement Thermocouple cuivre-constantan
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thermos permettent d’obtenir une vitesse de refroidissement voisine des 5°C.h-1 lorsque l’ensemble est placé dans un congélateur à -80°C. Une thermos contrôle est placée dans une chambre froide à +5°C. Les cinq autres sont placées dans le congélateur à -80°C. Les thermos étaient équipés de thermocouples ‘cuivre-constantan’ pour suivre le refroidissement des échantillons.
Les températures de conditionnement sont :
à l’automne et au printemps: +5°C, -5°C, -10°C, -15°C,-20°C et T°C < -50°C, en hiver : +5°C, -7,5°C, -15°C, -22,5°C, -30°C et T°C < -50°C.
La résistance au gel des arbres en conditions naturelles a été estimée seulement par la méthode du LT50.
2.7.3 Test de fuite des électrolytes : LT50
Cette méthode consiste à mesurer la conductivité électrique d’une solution d’eau ultra pure dans laquelle baigne un échantillon. Cette conductivité électrique est proportionnelle aux lyses cellulaires induites par les températures gélives. Le LT50 est un indice qui évalue la résistance au gel des végétaux. Il correspond à la température à laquelle 50% des cellules du matériel végétal analysé sont lysées par le gel.
Les échantillons sont redécoupés en petits morceaux. Ils sont introduits dans des tubes en verre (2,5 cm x 20 cm) contenant 15 ml de solution d’eau ultra pure (milliQ185). Ces tubes sont bouchés puis placés sur une table oscillante pour agitation (ST5, CAT, Allemagne), pendant 24 heures, à 5°C. Au bout de ces 24 heures, ils sont mis à température ambiante. Après que la température des tubes soit devenue égale à la température de la pièce, une première mesure de conductivité électrique (C1) est prise à l’aide d’un conductimètre (Held Meter LF340, TetraCon® 325). Pour obtenir la conductivité maximale, les échantillons sont autoclavés pendant 25 minutes à 120°C (Systec 2540ML). Ensuite, les échantillons sont placés à température ambiante pour refroidissement. Une deuxième mesure de conductivité (C2) est réalisée.
Dans la littérature, il existe deux méthodes pour évaluer la résistance au gel des échantillons (figure m.21) :
La première étape consiste à calculer un indice de mortalité (Flint et al, 1967 ; Pearce, 1980 ; Zhang et Willison, 1987) :
~ 113 ~ -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 .
A partir de cet indice, Flint et al (1967) et Pearce (1980) ont proposé que l’endurcissement au gel pouvait être définit en terme de 50% de lyse cellulaire (figure m.21, bleu) :
, où :
Cest le contrôle (échantillons conditionnés à +5°C),
ET°C est le matériel exposé à une température gélive.
Sutinen et al, (1992) utilisent directement la courbe « indice de mortalité en fonction de la température » (figure m.21, rouge). Pour eux, la température qui représente la résistance au gel est estimée à partir d’un pourcentage de lyse cellulaire maximal définit comme suit :
, où :
R1est l’indice de mortalité pour une lyse occasionnée par le gel maximal,
R2est l’indice de mortalité lorsque le matériel végétal n’a pas subit de gel.
Figure m.21 : Estimation de la résistance au gel selon Zhang et Willison (1987) (en bleu) et Sutinen (1992) (en rouge). % (du tota l) de lyse c e llulai re selo n la mé tho de classi que Température (-°C) LT50 LT50 ~ LT(R1+R2)/2 R1 R2 100 0 50 Indice d e morta lité
% (de ce qui peu
t être effectivemen t lysé par l e gel) de lys e cellulaire selon l a méthode Sutinen
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2.7.4 Le test GélistaTM
Le test GélistaTM (Améglio et al, 2001a ; Améglio et al, 2003) se base sur les propriétés suivantes : lors d’un cycle de gel/dégel, les organes d’un arbre, notamment les rameaux, montrent des variations de diamètre ; le gel extracellulaire entraîne une sortie d’eau de la cellule qui voit son volume diminuer et la cohésion entre les cellules induit une réduction du diamètre de l’organe ; lorsque la cellule n’est pas résistance au gel, une lyse cellulaire a lieu. Tout prend en glace et le diamètre de l’organe augmente.
Des fragments de rameaux d’un an de 5 cm sont utilisés pour le test GélistaTM. Ils sont enveloppés de parafilmTM pour éviter les pertes en eau du rameau. Un thermocouple cuivre-constantan est placé sous le parafilmTM pour suivre la température de l’organe. Des capteurs LVDT (modèle DF 2,5 et DF 5, SOLARTRON Metrology, Massy, France) sont utilisés pour suivre les variations du diamètre de l’organe. L’aiguille du capteur est maintenue sur l’organe par de la silicone (figure m.22). Le dispositif est placé dans une chambre de conditionnement. Les variations du diamètre sont enregistrées par un Delta-T-Logger (Delta-T Devices Ldt, Angleterre). Les données sont scrutées toutes les minutes et moyennées toutes les 5 minutes. Pendant l’année de 2004-2005, les échantillons ont subi un cycle de gel/dégel (programme n°1), suivi d’un choc thermique (programme n°2 année 2004-2005). En 2005-2006, le cycle de gel/dégel est répété en boucle (programme n°1 + programme n°2).
Figure m.22 : Schéma du dispositif du test GélistaTM.
Capteur LVDT Ressort Aiguille Rameau enveloppé de parafilme Thermocouple cuivre/constantan Fil d’alimentation et de transmission des données
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Le pourcentage de blessures causées par le gel est calculé en divisant la perte de diamètre après un cycle de gel/dégel (a) par la perte de diamètre maximal (b) (figure m.23).
Pour tester la résistance au gel de plantes entières, une chambre réfrigérée de 2 mètres de hauteur a été utilisée. La vitesse de refroidissement ou de réchauffement choisie est toujours la même (5°C.h-1). Un seul cycle de gel/dégel (-10°C/+5°C) a été appliqué sur les arbres. Des thermocouples cuivre/constantan sont utilisés pour mesurer la température du tronc, des rameaux de l’année, de l’air de l’enceinte et du sol. Les variations de diamètre du tronc ont été suivies grâce à des capteurs LVDT. Des centrales d’acquisition de type Delta-T-Logger enregistrent les températures et les variations du diamètre. Les données sont scrutées toutes les minutes, puis moyennées toutes les 5 minutes. Les signes de dommages liés au gel sont détectés par les variations de diamètre et par observation des tissus (les tissus endommagés par le gel développent des tâches brunes ou jaunâtres) (Holubowcz et al, 1982 ; Ketchie et Kammereck, 1987 ; Embree et McRae, 1991). Les observations visuelles et les tests de reprise de croissance au printemps sont des méthodes qualitatives. Elles sont utilisées simplement pour contrôler la vraisemblance de la mesure du LT50 (LT50 déterminé par le test GélistaTM ou par les deux méthodes de la fuite d’électrolytes).
(Améglio et al, 2001b ; Améglio et al, 2003), avec : a = ‘diamètre initial’ – ‘diamètre après 1 cycle’,
b = ‘diamètre initiale’ – ‘diamètre minimal’.
T emp ératu re (°C) Var iation de diamètr e (μ m) Temps (date) Formation de la glace en milieu
extracellulaire = cellule résistante
Toute l’eau prend en glace = cellule lysée
Figure m.23 : Exemple de courbe obtenue par le test GélistaTM sur rameau (courbe épaisse : diamètre de l’organe ; courbe fine : température de l’organe).
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