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Les plaques ainsi infectées sont incubées à 33°C sous 5% de CO2 pendant six à sept jours, temps nécessaire à l’apparition complète de l’ECP. L'ECP est caractérisé par une ballonisation et une individualisation des cellules avec apparition de vacuoles, formation de syncitia et désorganisation du tapis cellulaire jusqu'à la lyse des cellules et destruction du tapis cellulaire (Figure 21C et D). La fixation et la révélation sont faites par une coloration au MGG (May-Grünwald et Giemsa). Le milieu à 2% de SVF est tout d'abord éliminé des plaques par retournement puis 50 µL/puits de May-Grünwald sont ajoutés. Après 5 min d'incubation à température ambiante pour fixer les cellules, le May-Grünwald est éliminé par retournement et les plaques sont rincées une première fois à l'eau. Cinquante microlitres de Giemsa dilué au 1/10ème dans du PBS sont ajoutés dans chaque puits pour 15 min à température ambiante, puis de la même façon, le Giemsa est éliminé et les plaques sont rincées à l'eau.
Les plaques 96 puits sont alors observées au microscope inversé au grossissement x200, voire x400 si nécessaire, et les puits infectés sont comptabilisés. La méthode de Reed et Muench (Reed L.J. et Muench H., 1938) est employée pour évaluer le titre viral ou CCID50 ("Cell culture infective dose 50%" ou Dose infectant 50% des cellules) exprimé en particules virales infectieuses/mL (Figure 22). La limite inférieure de détection de la méthode par dilutions limites est de 5.102 particules infectieuses/mL.
2.4 Evaluation biologique de la rétention de molécules par le modèle de colonne :
cytotoxicité et viabilité
La cytotoxicité sur les cellules L-132 des molécules testées a été évaluée et quantifiée. Ceci nous a permis par la suite, en répétant les mêmes tests mais après filtration des solutions à tester sur les colonnes de Séphadex™, de s'assurer de l'élimination de la toxicité des molécules testées.
Pour chaque test, correspondent trois temps d'incubation différents, i.e. 24 h, 48 h et 168 h pour évaluer la toxicité dans les premiers temps de contact et pour avoir une toxicité à plus long terme. De plus, le temps 168 h, soit sept jours, correspond au temps nécessaire pour l'infection avec le HCoV 229E et l'accomplissement de son ECP.
2. Méthodes 2.4 Evaluation biologique de la rétention de molécules par le modèle de colonne : cytotoxicité et viabilité
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2.4.1 Etapes préliminaires communes aux tests de viabilité au MTT et de cytotoxicité au
RN
Les cellules L-132 sont ensemencées dans une boîte de culture de 75 cm², et après 48 à 72 h d'incubation, les tapis cellulaires alors confluents sont soumis à l'action de la trypsine pour individualiser les cellules. Trois plaques 96 puits, pour les trois temps d'incubation qui seront testés (24 h, 48 h et 168 h), sont ensemencées à 2.103 cellules/puits puis incubées à 37°C sous 5% de CO2. Après 48 h d'incubation, les cellules sont à environ 40% de confluence et les solutions dont la cytotoxicité doit être évaluée sont ajoutées.
Les solutions à tester sont préparées dans de l'eau osmosée stérile, puis la solution "mère" finale est soumise à une filtration stérilisante sur filtre 0,22 µm. Les colonnes 1, 2 et 12 servent de colonnes témoin : deux témoins négatifs, i.e. témoin X : milieu seul (colonne 1) et témoin Z : milieu + solution à tester (colonne 12) pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fausse réactivité, et un témoin positif Y ne contenant que des cellules et du milieu (colonne 2), qui servira de référence pour calculer les pourcentages de viabilité et/ou de cytotoxicité (Figure 23). La drogue à tester est ajoutée dans les puits en utilisant la méthode des dilutions sériées, i.e. 20 µL de la solution "mère" sont ajoutés dans chaque puits de la colonne 3, puis après homogénéisation par pipetages successifs, 20 µL sont prélevés puis déposés dans les puits de la colonne 4 et ainsi de suite jusqu'à la colonne 11 où les 20 µL excédentaires sont éliminés pour avoir un volume équivalent dans tous les puits et pour qu'il
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Concentrations décroissantes de la solution à tester
Témoin X : milieu seul (contrôle négatif ) Témoin Y : cellule (contrôle positif )
Témoin Z : milieu + solution à tester (contrôle négatif )
2. Méthodes 2.4 Evaluation biologique de la rétention de molécules par le modèle de colonne : cytotoxicité et viabilité
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n'y ait pas d'interférence lors des mesures spectrophotométriques. Les plaques sont ensuite incubées à 37°C sous 5% de CO2, pour les temps d'incubation définis précédemment.
2.4.2 Tests de viabilité au MTT
Le protocole de ce test au MTT suit un protocole modifié de Mosmann (Mosmann T., 1983). Après 24 h, 48 h et 168 h d'incubation, une des plaques 96 puits est retirée de l'incubateur, le milieu de culture est éliminé par retournement et 100 µL de PBS/puits sont ajoutés. Dix microlitres d'une solution de MTT à 5 mg.mL-1 dans du PBS sont ajoutés, puis la plaque est replacée dans l'incubateur pendant 4 h à 37°C sous 5% de CO2. Afin de dissoudre les cristaux bleu foncé de formazan formés, 100 µL d'une solution de SDS (Sodium dodecyl sulfate) sont ajoutés dans chaque puits puis la plaque est ré-incubée pendant 4 h à 37°C sous 5% de CO2. A l'issue de ces 4 h, les mesures spectrophotométriques sont effectuées sur un lecteur de plaques ELISA à la longueur d'onde de 540 nm. Une autre mesure est également réalisée à 690 nm, longueur d'onde de référence. Les absorbances prises en compte dans les calculs suivants correspondent aux moyennes des absorbances obtenues dans les puits d'une même colonne après lecture à 540 nm auxquelles sont retranchées celles obtenues après lecture à 690 nm.
Les pourcentages de viabilité des cellules en présence des molécules à tester sont alors calculés grâce à la formule suivante :
Équation 1 : Pourcentage de viabilité cellulaire
!"# % &'"(')'!é = *+ éℎ" !')) − + !é.' /+ !é.' 0 − + !é.' 1 2 × 100
où l'échantillon correspond aux puits contenant les cellules et la solution à tester, le témoin X correspond au témoin milieu seul, le témoin Y correspond au témoin cellule (100% de viabilité) et le témoin Z correspond au témoin milieu + solution à tester.
Les CI50 ("concentration inhibitrice 50%" soit la concentration inhibant la croissance de 50% des cellules) correspondent alors à la concentration du produit testée engendrant une perte de 50% dans la viabilité cellulaire.
2. Méthodes 2.4 Evaluation biologique de la rétention de molécules par le modèle de colonne : cytotoxicité et viabilité
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2.4.3 Tests de cytotoxicité au RN
Le protocole pour le test de cytotoxicité au RN suit un protocole modifié de Borenfreund (Borenfreund E. et Borrero O., 1984, Borenfreund E. et Puerner J.A., 1985). Une solution stock de RN à 4 mg.mL-1 dans de l'eau osmosée est préalablement préparée puis centrifugée à 405xg pendant 10 min pour éliminer les éventuels agrégats. Pour chaque test, une solution à 50 µg.mL-1 est préparée extemporanément à partir de cette solution stock dans du MEM sans glutamine et sans rouge de phénol, pour ne pas gêner les mesures spectrophotométriques ultérieures, puis filtrée sur un filtre 0,45 µm pour éviter les fins précipités qui peuvent se former lors du mélange entre le RN et le MEM. Deux autres solutions sont également préparées au préalable :
- Une solution A de rinçage pour enlever l'excès de RN et améliorer la fixation des cellules sur le support. Elle contient 4% (v/v) de formaldéhyde à 36,5% (v/v) et 1% (m/v) de chlorure de calcium (CaCl2) dans de l'eau osmosée
- une solution B permettant la lyse cellulaire et contenant 1% (v/v) d'acide acétique, 50% d'éthanol absolu (v/v) dans de l'eau osmosée.
A chaque temps d'incubation, i.e. 24 h, 48 h et 168 h, une des plaques est retirée de l'incubateur et le milieu de culture est éliminé par retournement. Les tapis cellulaires sont rincés avec 200 µL de PBS et 200 µL de la solution de RN à 50 µg.mL-1 sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite replacée dans l'incubateur pendant 3 h à 37°C sous 5% de CO2. La solution de RN est éliminée par retournement. Les puits sont rincés avec 200 µL de la solution A. Cette dernière est éliminée sans attendre par retournement de la plaque, pour ne pas endommager les lysosomes à cette étape, ce qui provoquerait l'extraction prématurée du colorant. Les puits sont alors remplis avec 200 µL de la solution B et la plaque est incubée pendant 20 min à 37°C sous 5% de CO2. Après agitation des plaques, la quantité de RN libérée est mesurée par lecture spectrophotométrique à 540 nm.
La cytotoxicité est alors évaluée grâce à la formule suivante :
Équation 2 : Pourcentage de cytotoxicité
!"# % 5!!6''!é = 100 − 7*A échantillon − A témoin ZA témoin Y – A témoin X 2 × 1008
L'échantillon correspond aux puits contenant les cellules et la solution à tester, le témoin X correspond au témoin milieu seul (0% de cytotoxicité), le témoin Y correspond au témoin cellule et le témoin Z correspond au témoin milieu + solution à tester.
2. Méthodes