Evaluation de l'aptitude au croisement du blé avec le seigle

Le test d'aptitude au croisement est réalisé en utilisant la variété de seigle cultivé

Secale cereale L. Dankowskie Nowe. Les parents Ct, CS et MP98 et les individus SSD

recombinants (issus de la population MP98 x Ct, Figure 17) sélectionnés entre les deux marqueurs moléculaires gpw1072 et dl103 dans l'étude précédente (LAMOUREUX 2002) ont été réévalués ainsi que certains individus pour lesquels une donnée de génotypage ou de phénotypage était manquante dans l'étude précédente (LAMOUREUX 2002). Au total, 116 SSD ont été inclues dans ce test.

116

Figure 19 : A : Photo prise en serre pour les individus testés en 2005. B : différentes parties d'une plante de blé, source : (http://www.plant-pictures.de/). C : Epi de blé avec 20 fleurs émasculées (2 fleurs laissées sur chaque épillet x 10 épillets médians), protégées de la pollinisation non contrôlée par un sac.

3.2. Méthode

Le test d'aptitude au croisement se fait toujours en utilisant le blé comme parent femelle avec le pollen du seigle cultivé var. Dankowskie Nowe. L'émasculation du blé se fait généralement quand les deux tiers de l'épi sont sortis de la gaine, mais pour quelques lignées il a fallu attendre que l'épi soit complètement sorti. Deux à 4 épis et 20 fleurs (3 étamines/ fleur, Figure 19B) par épi ont été émasculés 24-48h avant pollinisation pour chaque individu testé. Les 20 fleurs par épi ont été assurées en gardant les 5 épillets médians de chaque face de l’épi (Figure 19C). Toutes les fleurs de l’épillet sauf les deux fleurs extérieures ont été enlevées pour assurer une maturité uniforme de tout l’épi. Les autres épillets apicaux et basiques ont été aussi enlevés (Figure 19C). Les stigmas sont ensuite pollinisés par du pollen frais de seigle cultivé dans la même serre. La vitesse de développement différant entre blé et seigle, 3 semis de seigle (plantés à 7 jours d'intervalle) sont disponibles afin d'assurer une production de pollen constante durant les croisements. Avant et après pollinisation, les épis émasculés sont couverts par des sacs afin d'éviter des pollinisations non contrôlées (Figure 19C). Chaque épi est étiqueté avec le nom de l'individu, la date de l'émasculation, la date de la pollinisation et le nom du manipulateur. Un double de chaque lignée SSD est systématiquement mis en serre pour fournir une plante de remplacement au cas où un incident se produirait sur la première plante.

3.3. Contrôles

Afin d'assurer un phénotypage homogène, reproductible et de qualité pour un caractère difficile à évaluer, des contrôles de l’homogénéité des résultats issus des différents épis émasculés de chaque plante ont été réalisés deux fois après pollinisation (après 10 jours, la formation des grains peut déjà être observée dans l'épi). Lorsqu'une différence remarquable était observée entre deux épis d'une même plante, un troisième voire un quatrième épi ont été testés à partir de la même plante. Un contrôle supplémentaire a été réalisé l’année suivante (2006) pour les plantes dont les épis n'avaient pu être exploités lors du premier contrôle en 2005, faute de coïncidence de floraison. Ces précautions ont permis de réduire au mieux les erreurs expérimentales.

3.4. Calcul du pourcentage d’aptitude au croisement

40 à 50 jours après pollinisation, le nombre de grains obtenus par épi est compté et l’aptitude au croisement transformée en pourcentage en divisant le nombre de grains obtenus par épi par le nombre total de fleurs émasculées sur l'épi. Si un stigmate est endommagé lors

118 A Inapte au croisement B AABBDDRR Apte au croisement X RR AABBDD Blé tendre Triticum aestivum Seigle Secale cereale Autofécondation AABBDD C A Inapte au croisement B AABBDDRR Apte au croisement X RR AABBDD Blé tendre Triticum aestivum Seigle Secale cereale Autofécondation AABBDD C

de l’émasculation (observé lors de la pollinisation) ou si des grains non hybrides (autofécondation accidentelle) sont observés, une correction est réalisée en remplaçant la valeur 20 par la valeur corrigée. Le pourcentage moyen de l’aptitude au croisement est ensuite calculé à partir des rapports obtenus pour chacun des épis d'une même plante :

AC (%) = ∑ (((g1/f1) + (g2/f2) +…+ (gn/fn))/E)*100

Où : AC : aptitude au croisement exprimée en (%) g : nombre de grains obtenus par épi.

f : nombre de fleurs émasculées par épi, normalement 20 fleurs. E : nombre d’épis testés par plantes

Ce calcul est préférable a une estimation plus simplifiée du type AC (%) = (g total/f total)*100 car il permet de calculer un écart type et un intervalle de confiance qui rendent compte des erreurs expérimentales.

3.5. Définition des classes d’aptitude au croisement

Un individu est dit inapte au croisement (non croisable) lorsque la valeur d'aptitude observée est située dans l’intervalle observé pour le parent non croisable Courtot (0-10%) (Figure 20A). Un individu est dit apte au croisement (croisable) avec le seigle lorsque la valeur d'aptitude observée est incluse dans l'intervalle obtenu pour le parent croisable (ici MP98, 59-81%). Les grains hybrides blé-seigle comportent un albumen rempli suite à la réussite de la fécondation. L’aspect et la couleur des grains permettent de différencier les vrais hybrides des grains de blé qui ont pu se former (par castration mal faite ou contamination lors de la pollinisation) : les grains hybrides sont petits, ridés et sombres (Figure20B), tandis que les grains de blé sont plus gros, lisses et clairs (Figure20C).

4. Analyses moléculaires

4.1. Extraction d’ADN génomique

L'ADN est extrait à partir de feuilles au stade de développement 8-10 feuilles afin d’assurer l'obtention d'une quantité suffisante d’ADN à partir de 3 à 5 g de matériel frais et pour éviter un impact négatif sur le développement futur des plantes. Après le prélèvement, les feuilles sont plongées immédiatement dans l’azote liquide, puis le matériel est broyé dans un mortier. Le broyat est ensuite transféré dans des tubes "Falcon 50 ml" et l’ADN extrait avec un protocole au CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, Sigma) 1.3X. Ce protocole permet d'obtenir une grande quantité d’ADN de qualité suffisante pour réaliser

plusieurs membranes de Southern. La qualité et la quantité d’ADN sont vérifiées sur gel d’agarose 0.8% et par dosage au spectrophotomètre (DO à 260 et 280 nm).

Tous les individus testés pour leur phénotype (116 SSDs, MP98, CS et Ct) ont été caractérisés avec les marqueurs moléculaires gpw1072 (SSR) et dl103 (RFLP) localisés dans la partie distale du bras chromosomique 5BS (délétion 5BS6-0.81-1.00, Figure 18) et utilisés pour la sélection des recombinants avant le début de ce travail de thèse. Les recombinants sélectionnés entre les deux marqueurs ont ensuite été caractérisés à l'aide de nouveaux marqueurs moléculaires. Des marqueurs sur les chromosomes 5BL et 5AL ont également été utilisés afin d'étudier la composition allélique aux locus Kr1 et Kr2, respectivement.

4.2. Analyses par marqueurs SSR

Le polymorphisme des marqueurs SSR a été détecté par électrophorèse en utilisant deux méthodes :

1. La visualisation par la methode de nitrate d’argent non-radioactive après migration sur gel d’acrylamide 6% (Sigma–Aldrich, Missouri, USA) pendant 2h à 2000V. Les marqueurs SSR ont été amplifiés par PCR dans les conditions suivantes : 3 µl d'ADN (10 ng/µl) ont été ajoutés à 2 µl de Tampon 10X contenant 31 mM MgCl2, 4 µl de la solution Q, 0.8 µl de TAQ Polymerase (Qiagen, Hilden, Germany), 0.4 µl d'un mélange de dNTP (10 mM), 1µl de chaque amorce (10µM) dans un volume total de 20µl. L’amplification est réalisée dans un thermo-cycler (MJ Research PTC-225) avec 30 cycles de 30s à 95°C, 30s à 55-65 °C selon le Tm° spécifique des amorces utilisées, et 30s à 72°C, suivi d'une élongation finale de 5 minutes à 72°C.

2. La visualisation par électrophorese capillaire (ABI PRISM®3100, Applied Biosystems). Les amplifications sont realisées dans un volume final de 7 µl dans les conditions suivantes : 3 µl d'ADN (10 ng/µl) ont été ajoutés à 0.65 µl de Tampon 10X, 0,04 µl Taq polymerase, 0.65 µl de mix d'amorces (amorces gauche avec extention M13 : 50 nM et amorce droite : 500 nM), 0.034 µl d'amorce M13 marquée, 0.27 µl d'un mélange de dNTP (10 mM) et completé avec 2.35 µl d'H2O. L’amplification a été réalisée en utilisant un programme « universel » qui permet d'amplifier en même temps des SSRs ayant des températures de fusion spécifiques différentes (Tm°) :

Step T °C Time 1 95 °C 5 mn 2 95 °C 30 S 3 62 °C 30 S -1 °C per cycle 4 72 °C 30 S 5 GoTo 2, 7 times 6 95 °C 30 S 7 55 °C 30S 8 72 °C 30 S 9 GoTo 6, 30 times 10 95 °C 30 S 11 56 °C 30 S 12 72 °C 30 S 13 GoTo 10, 8 times 14 72 °C 5 mn 15 15° C for ever 16 End

4.3. Analyses par marqueurs RFLP

20 µl d’ADN génomique (1µg/µl) de chaque lignée parentale et chaque individu de la population ont été individuellement digérés par 5 enzymes de restriction : EcoRI, EcoRV, DraI, HindIII et BamHI (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA, USA) en utilisant 4 unités d’enzyme pour chaque 1 µg d’ADN génomique. La reaction de digestion est complétée à 35 µl avec 3.5 µl de Tampon 10X approprié pour chaque enzyme et de H2O et est incubée à 37°C pendant 3h minimum. L’ADN digéré est alors séparé sur gel d’agarose 1% (Sigma) pendant 16h à 35V. L'ADN est transféré sur une membrane de nylon (Bio-Rad, Hercules, CA) par transfert alcalin (NaOH 0,4 M et NaCl 35g/L) pendant 24h. Les membranes sont ensuite hybridées (Southern) à l'aide de sondes marquées radio-activement par du dCTP32en utilisant le kit de marquage Amersham (Megaprime DNA Labelling System kit, Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK, www6.gelifesciences.com/). Après hybridation pendant une nuit à 65°C dans un four rotatif, les membranes sont rincées 3 fois (30/5/5 mn) avec un tampon 0.5x SSC, 0.1% SDS et emballées dans un film plastique pour éviter la dessiccation et la fixation des sondes de manière définitive. La membrane est ensuite mise en contact avec un film auto-radiographique dans une cassette puis stockée à -80°C de 2 à 5 nuits selon l’intensité du signal. Le film est ensuite développé et séché (développeuse automatique Amersham).