Etudes préliminaires et perspectives sur l’étude des cibles moléculaires de MMP-

Comme nous l’avons évoqué l’effet des MMPs s’exerce via leurs actions sur les composants de la MEC mais aussi via leurs actions sur des facteurs solubles activables par ces MMPs et/ou des facteurs piégés dans la MEC.

Afin de déterminer si l’action de MMP-9 passe par la dégradation des composants matriciels, nous avons d’abord évalué l’influence de différents supports matriciels tels que des supports de collagène, fibronectine et gélatine, connus pour être des substrats de la MMP- 9 (57, 254), sur l’adipogenèse des cellules de la FSV du TA humain. Pour cela, des cellules de la FSV du TA ont été ensemencées (60 000 cellules/cm2_{) sur ces différents supports et}

mises en conditions adipogéniques. Après 10 jours de culture, le contenu intracellulaire en TGs a été quantifié. Comme on peut l’observer dans la figure 16, aucun des supports matriciels testés n’affecte l’accumulation lipidique des préadipocytes humains, un résultat ne suggérant aucune altération de leur adipogenèse.

Ces données sont en accord avec d’autres travaux soulignant l’absence d’effet d’un support de collagène (191) et de fibronectine (95) sur l’adipogenèse des cellules de la FSV de TA humains et porcins, respectivement. A l’inverse, d’autres travaux ont rapporté un effet anti-différenciant d’un support de fibronectine sur des préadipocytes d’origine murine et humaine (98, 191, 260). Les différences observées dans ces études sont surprenantes et pourraient s’expliquer par le modèle cellulaire et/ou les conditions de culture utilisées. On note qu’un support de laminine décrit pour activer l’adipogenèse des préadipocytes porcins (95) a également été testé mais ce support n’a pas permis l’adhérence des cellules de la FSV du TA humain. Ainsi, ces résultats ne révélant aucun effet du support matriciel sur l’adipogenèse, il est tentant de suggérer que l’activité de MMP-9 n’est pas due à la dégradation de la MEC. Il faut cependant rester prudent car il est fort possible que l’action de MMP-9 passe par la dégradation d’une MEC sécrétée par la cellule, elle-même, et non pas par celle déposée au préalable sur un support. De plus, il est possible que le modèle de culture en 2 dimensions utilisé pour nos cellules ne permette pas d’observer un effet du support

Plast ique Collagè ne Fibron ectin e Gélati ne 0 25 50 75 100 125 C on te nu e n trig ly cé rid e (m g/ mg d 'ADN)

Figure 16 : Influence d’un substrat matriciel sur la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV du tissu adipeux humain

Les cellules de la FSV sont cultivées sur un support plastique ou coatéavec du collagène de type IV, de la fibronectine, ou de la gélatine en conditions adipogéniques. A 10 jours de différenciation, le contenu intracellulaire en TGs normalisé à la quantité d’ADN a été évaluépour 4 expériences indépendantes. Les résultats sont exprimés en % du contrôle sur support plastique.

matriciel. L’influence de différents supports matriciels dans un modèle de culture en 3 dimensions est à envisager. En effet, une étude récente montre que des effets de la MT1- MMP ne sont révélés que sur un modèle de culture en 3 dimensions (44).

En parallèle, il serait très intéressant de caractériser les principaux composants matriciels sécrétés par les cellules de la FSV du TA humain en cours de différenciation traitées ou non avec un inhibiteur de MMP-9. Une telle étude permettrait non seulement de déterminer l’évolution de la MEC au cours de l’adipogenèse chez l’homme mais aussi de définir les effets de cette métalloprotéase sur les composants matriciels. De plus, MMP-9 étant connu pour générer des fragments matriciels biologiquement actifs tels que l’endostatine (77) et certains peptides dérivés de la fibronectine (82), un traitement des cellules de la FSV du TA humain par des fragments matriciels pourraient être envisagé. En effet, les travaux de Kamiya et al. montrent qu’un fragment issu de la dégradation de la fibronectine stimule la différenciation des préadipocytes de la lignée ST-13 (119).

Enfin, la recherche des cibles non matricielles susceptibles de moduler et réguler le comportement cellulaire pourrait également être envisagée. De nombreuses protéines cellulaires de surface, péri-cellulaires ou circulantes peuvent être clivées par les MMPs régulant ainsi leur biodisponibilité. Cependant, peu de données existent chez l’homme. Il nous semblerait donc intéressant de caractériser notamment la production des facteurs de croissance et/ou cytokines par les cellules de la FSV du TA humain au cours de la différenciation. Cette approche pourrait être réalisée grâce à l'utilisation de la technique des immunoarrays dédiés aux « cytokines » qui permet d’identifier et de quantifier, dans un milieu de culture ou dans un lysat cellulaire, des protéines différentes décrites comme étant des cibles de MMP-9 dans d’autres modèles cellulaires et dont les effets sur la différenciation cellulaire ont été également mis en évidence telles que les TGFs, TNFs, ILs, IGF-I, IGFBPs. En parallèle, l’influence d’un traitement avec un inhibiteur de MMP-9 pourra être évaluée et ce, afin de mettre en évidence les facteurs de croissance et/ou cytokines dont le taux extracellulaire est modifié par la présence de MMP-9 soit par leur clivage direct soit par leur libération de la MEC.

Pour conclure, l’étude des cibles moléculaires de MMP-9 constitue donc un axe de recherche dont le développement pourrait permettre de mieux comprendre les effets de la MMP-9. Cependant, les cellules de la FSV étant une population cellulaire hétérogène, on peut se demander quels types cellulaires sont les cibles de MMP-9. Récemment, des travaux de notre groupe ont permis d’isoler et de caractériser la population cellulaire contenant les

précurseurs adipocytaires (241). Dans la suite de ce travail, nous avons déterminé si l’effet de la MMP-9 est retrouvé dans ces précurseurs adipocytaires spécifiquement isolés.

II- Implication des MMPs dans la différenciation des cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain

La caractérisation et l’isolement de la population cellulaire contenant les précurseurs adipocytaires a été possible grâce au développement d’une technique d’isolement des différentes populations cellulaires de la FSV qui se fonde sur l’utilisation de nanoparticules magnétiques couplées à des anticorps dirigés spécifiquement contre les marqueurs de surface CD34 (marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales capillaires), CD31 (marqueur des cellules endothéliales et de la lignée hématopoïétique) et CD14 (marqueur des monocytes/macrophages) (figure 17). La fraction cellulaire CD34+/CD31- est la seule à exprimer les marqueurs de différenciation spécifiques des adipocytes et à acquérir les activités métaboliques adipocytaires, en réponse aux conditions adipogéniques (241).

Notre groupe a également mis en évidence que ces cellules CD34+/CD31-, cultivées en condition de culture endothéliales, changent de morphologie et d’organisation et expriment des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales tels que le CD31 et le facteur de Von Willebrand (vWF). De plus, leur injection dans la patte ischémiée d’une souris athymique entraîne une augmentation du flux sanguin et de la densité capillaire au niveau du membre ischémié (173). D’autres laboratoires ont rapporté des capacités pro-angiogéniques similaires des cellules issues de la FSV du TA (211, 221, 291). Par conséquent, la fraction cellulaire CD34+/CD31- pourrait constituer un pool local de cellules progénitrices/souches qui serait impliqué dans la formation non seulement des nouveaux adipocytes mais aussi des capillaires accompagnant le développement de la masse grasse.

Les mécanismes impliqués dans le contrôle du devenir des cellules progénitrices CD34+/CD31- restent à déterminer. Il a été rapporté que le microenvironnement pouvait réguler le devenir des cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses (127, 229). En effet, de nombreux facteurs solubles (cytokines et facteurs de croissance) ainsi que la composition et l’élasticité de la MEC contrôlent le devenir des cellules souches (14, 69, 71, 172). De plus, une récente publication indique que l’engagement des cellules souches mésenchymateuses vers le lignage adipogénique et ostéogénique est régulé par la densité cellulaire d’ensemencement qui altère la forme de la cellule et module les interactions cellulaires (167).

Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons d’abord vérifié et confirmé l’implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des cellules CD34+/CD31-

Fraction stroma-vasculaire