R´ esultats

Le travail d’optimisation s’est effectu´e de mani`ere identique pour l’´etude de chaque param`etre cible. Nous d´etaillerons d’abord ci-dessous, le modus operandi pour l’optimisation selon la concentration initiale et les r´esultats. Ensuite la d´emarche ´etant la mˆeme, nous pr´esenterons uniquement les r´esultats pour les autres param`etres.

Optimisation selon la concentration initiale d’enzyme, E0

Nous avons fait varier la concentration initiale, E0, entre 1 et 100 U/mL. Apr`es plusieurs

optimisations en ciblant E0de toutes les enzymes, nous avons obtenu la r´epartition des valeurs

de chaque enzyme, figure2.6. En optimisant la valeur E0 de chaque enzyme, le syst`eme est

parvenu `a un optimum proche de 591 mM d’hydrog`ene produit apr`es 9000 minutes (figure

2.6b). A partir de l’analyse de la r´epartition des valeurs, nous avons constat´e que dans toutes les solutions propos´es par l’algorithme g´en´etique seule les valeurs E0 des enzymes #3, #4,

et#13 ´etaient fix´es au maximum (figure 2.6a). Ainsi ces enzymes semblent prioritaires pour une optimisation selon E0. Pour les autres enzymes nous relevons deux types de r´epartitions

(figure2.6a) :

ˆ l’ensemble des E0 est peu r´eparti et fix´e `a une valeur inf´erieure ou proche de 10U/mL .

Or 10U/mL est la valeur de E0 du syst`eme initial, avant optimisation, ces enzymes ne

pr´esentent donc pas d’int´erˆet `a ˆetre modifi´ees pour obtenir plus d’hydrog`ene. C’est le cas pour les enzymes :#1, #7, #9, #10 et #12.

ˆ l’ensemble des E0 est tr`es r´eparti entre 10 et 100 U/mL. Ces enzymes semblent contri-

buer `a augmenter la production en H<sub>2</sub> mais tr`es faiblement, quelque soit leur valeur, la production est proche de 590 mM de H₂(figure 2.6b). Ce ph´enom`ene est observ´e dans les enzymes :#2, #5, #6, #8 et #11.

Nous avons d´ecid´e ensuite de d´eterminer l’ensemble minimal d’enzymes utiles `a cibler pour optimiser selon E0. L’analyse des r´epartitions sugg`ere que les enzymes #3, #4, et#13 sont

de bons candidats. En introduisant le maximum possible pour ces 3 enzymes, la synth`ese d’hydrog`ene est de 582 mM (voir table2.6), soit 98% de H₂produit apr`es l’optimisation sur les 13 enzymes en mˆeme temps. Ainsi l’optimisation avec les 10 autres enzymes, en compl´ement, ne procure seulement qu’une augmentation de 9 mM. Les enzymes #3, #4, et#13 sont donc l’ensemble minimal d’enzymes `a modifier. En jouant sur les diff´erentes combinaisons d’optimisation possibles avec ces enzymes nous avons pu d´eterminer que la perte d’une de ces enzymes dans une combinaison diminue fortement la production finale( voir tableau2.6). La modification #13 seule contribue le plus `a l’optimisation de la production.

Enzyme modifi´e E0 optimis´ee (U/mL) optimum [H2] (mM)

#3, #4 et #13 E0 =100 582

#3, #4 E0(#3) = 84, E0(#4)100 119

#13, #3 E0(#3)=12, E0(#13)=100 336

#13, #4 E0 =100 454

#13 E0 =100 334

Table 2.6: ´Evaluation du couple d’enzymes #3, #4 et #13 comme ensemble minimale d’enzymes, au niveau d’une optimisation en fonction de leur concentration initiale. La modi- fication des 3 enzymes simultan´ement permet d’obtenir le maximum, 582 mM de H₂. Cette production repr´esente 98% de la production d’hydrog`ene issue de la modification simultan´ee de la concentration initiale des 13 enzymes du syst`eme.

(a)

(b)

Figure 2.6: R´epartition sous forme de boˆıte `a moustache des valeurs : de E0 pour chaque enzyme apr`es multiples optimisations, figure 2.6a,

et de la concentration finale en H₂ associ´ee, figure 2.6b.

Figure2.6a en abscisse : E1 correspond `a E0 pour l’enzyme #1, E2 pour l’enzyme #2, de la

mˆeme fa¸con pour les autres variables en abscisse, en ordonn´ee la valeur de la concentration E0 en U/mL.

Optimisation selon la constante catalytique, kcat

La constante kcat peut prendre une valeur entre 0.001 et 1 mmol*ml/min/U dans nos travaux d’optimisation. Pour rappel, kcat traduit la vitesse de synth`ese de produit par quantit´e d’enzymes, plus sa valeur est grande plus la r´eaction est rapide.

(a)

(b)

Figure 2.7: R´epartition sous forme de boˆıte `a moustache des valeurs : de kcat pour chaque enzyme apr`es multiples optimisations, figure 2.7a, et de la concentration finale en H₂ associ´ee, figure 2.7b.

Figure2.7aen abscisse : kcat1 correspond au kcat pour la r´eaction r1, kcat2 pour la r´eaction r2, de la mˆeme fa¸con pour les autres variables en abscisse, en ordonn´ee la valeur de la constante kcat en mmol*ml/min/U.

L’impact du kcat est tr`es fort sur la production d’hydrog`ene. Nous sommes parvenu `a une production d’environ 810 mM (figure2.7b) en modifiant le kcat de l’ensemble des enzymes, soit 95% du rendement final th´eorique. Selon la figure 2.7a les enzymes #4, et #13 sont des bons candidats pour obtenir un ensemble minimal. Nous avons choisi de regarder aussi l’effet de l’enzyme #3 car il fonctionne conjointement avec l’enzyme #4 pour la production de NADPH et que la r´epartition de ses valeurs, apr`es optimisation, reste proche de 0.6 mmol*ml/min/U. Nous avons pu atteindre une production de 799 mM d’H2 (voir table 2.7)

en alt´erant conjointement leur valeur de kcat, soit 98% du r´esultat issu de la modification des 13 enzymes `a la fois. Dans cette situation , il faut remarquer que le kcat de l’enzyme #3 doit ˆetre au niveau de la borne maximale, 1 mmol*ml/min/U et non proche de 0.6 mmol*ml/min/U comme dans le cas de l’´etude sur les 13 enzymes `a la fois.

Enzyme modifi´e kcat optimis´ee (mmol*ml/min/U) optimum [H₂] (mM) #3, #4 et #13 kcat =1 799

#3, #4 kcat(#3) = 0.25, kcat(#4)=1 117 #13, #3 kcat(#3)=1, kcat(#13)=1 504 #13, #4 kcat =1 535

#13 kcat =1 453

Table 2.7: Evaluation du couple d’enzymes #3, #4 et #13 comme ensemble minimale, au niveau d’une optimisation en fonction de la constante kcat. La modification des 3 enzymes simultan´ement permet d’obtenir le maximum, 799 mM de H₂. Cette production repr´esente 98% de la production d’hydrog`ene issue de la modification simultan´ee de la constante kcat des 13 enzymes du syst`eme.

Optimisation selon la constante de Michaelis-Menten, Km

Nous avons choisi de borner le param`etre Km entre la valeur du Km du syst`eme initiale, Km0, et une valeur ´egale au dixi`eme de l’autre borne, soit Km0/10. Les valeurs Km0 sont

indiqu´ees dans le tableau 2.3. Plus le Km d’une enzyme pour un substrat est petit, plus l’enzyme pr´esente de l’affinit´e pour ce substrat et plus le complexe enzyme-substrat se forme facilement.

Chaque m´etabolite d’une r´eaction est associ´e `a un Km pr´ecis. Nous avons donc pour une r´eaction, plusieurs valeurs de Km qui lui sont associ´ee. Nous avons dans le mod`ele 19 Km diff´erents (figure 2.3).

Cette s´erie d’optimisation a permis d’atteindre une production de 238 mM d’hydrog`ene. Nous avons identifi´e par la suite le ensemble minimal d’enzymes. Sur la figure 2.8a nous avons relev´e les Km dont les valeurs se r´epartissaient autour de Km0/10 : Km n°7, soit

le Km de 6PG dans la r´eaction 4 ; Km n°8, soit le Km de NADP dans la r´eaction 4 ; Km n°19, soit le Km de NADPH dans la r´eaction 13. Les autres Km avaient une r´epartition ´

elev´ee, ou elles se bornaient `a la valeur de leur Kmi, dans ce cas la diminution de leur valeur diminue le rendement en H2. Le tableau 2.8 montre que la modification de ces 3 Km

simultan´ement, donne les mˆemes r´esultats que ceux obtenus en modifiant l’ensemble des enzymes, c’est `a dire une production d’hydrog`ene finale de 238 mM. Ainsi seuls ces 3 Km participent `a l’optimisation via la constante Km. La modification de Km n°8 et celle de Km n°19 procurent un seuil de production de 236 mM. Nous pouvons consid´erer que les variables `

a modifier dans le ensemble minimal sont le Km n°8 et le Km n°19 dans une optimisation via Km. Km modifi´e optimum [H₂] (mM) 7, 8, 19 238 19 172 7, 8 119 7, 19 174 8,19 236

Table 2.8: Evaluation de Km comme ensemble minimale au niveau de l’optimisation de l’hydrog`ene. 7=Km 6PG, r4 ; 8=Km NADP, r4 ; 19=Km NADPH, r13.

(a)

(b)

Figure 2.8: R´epartition sous forme de boˆıte `a moustache des valeurs : de Km apr`es optimisations, figure 2.8a,

et de la concentration finale (mM) en H₂ associ´ee, figure 2.8b. Figure2.8a repr´esente en abscisse les diff´erents Km :

: 1 : KmPi de la r´eaction r1 ; 2 : KmCb de la r´eaction r1 ; 2 : KmCb de la r´eaction r2 ; 3 : KmG1P de la r´eaction r2 ; 4 : KmG6P de la r´eaction r2 ; 5 : KmG6P de la r´eaction r3 ; 6 : KmNADP de la r´eaction r3 ; 7 : Km6PG de la r´eaction r4 ; 8 : KmNADP de la r´eaction r4 ; 9 : KmRu5P de la r´eaction r5 ; 10 : KmRu5P de la r´eaction r6 ; 11 : KmDHAP de la r´eaction r9 ; 12 : Kmg3P de la r´eaction r9 ; 13 : KmDHAP de la r´eaction r10 ; 14 : Kmg3P de la r´eaction r10 ; 15 : KmFdP de la r´eaction r11 ; 16 : KmF6P de la r´eaction r12 ; 17 : KmG6P de la r´eaction r12 ; 18 : KmNADP de la r´eaction r13 ; 19 : KmNADPH de la r´eaction r13 (voir la table2.3 pour identifier les diff´erents Km). L’ordonn´ee affiche la valeur de Km en mM.

Optimisation selon la constante de d´egradation, λ

Lors de cette ´etude, seules les enzymes avec λ ≥ 0.000154033 min−1, c’est `a dire avec un temps de demi-vie inf´erieure ou ´egale `a 75 heures, ont ´et´e analys´ees(voir la figure 2.3). Ainsi la d´egradation des enzymes #1-4, #5, #7-9, #12 a fait l’objet de l’´etude.

Cette approche a peu contribu´e `a l’optimisation de la production d’hydrog`ene. Le syst`eme n’a pu produire que 118 mM d’hydrog`ene soit uniquement 6 mM de plus par rapport au syst`eme initiale. Nous avons pu observer que la modification de la constante de d´egradation des enzymes #3 et #4, suffisait `a obtenir cette production de 118 mM.

Optimisation selon deux param`etres cibles

L’optimisation portant uniquement sur le kcat, est la meilleure pour augmenter la production de H2 en jouant sur un seul type de param`etre. Nous avons voulu essayer d’augmenter le

rendement de la production en combinant les param`etres. Nous avons utilis´e simultan´ement deux param`etres cibles pour observer leur effet sur le rendement en H2 :

ˆ E0+ λ

ˆ E0+ Km

Nous avons s´electionn´e des couples avec E0 car il est le param`etre le plus facile `a modifier

exp´erimentalement sans appliquer de modification g´en´etique. Nous avons d’abord pris une so- lution de l’optimisation via E0o`u la concentration initiales de chaque enzyme ´etait modifi´ees.

A partir de cette solution qui donnaient pr`es de 590 mM, nous effectu´e une optimisation en variant les valeurs de λ ou Km et obtenu les r´esultats suivant

ˆ E0+ λ : 815mM

ˆ E0+ Km : 827 mM

Nous avons pris les ensembles minimaux des diff´erents param`etres et les valeurs associ´ees, d´etermin´es pr´ec´edemment. Nous avons obtenu :

ˆ 793 mM d’hydrog`ene en modifiant la concentration E0 des enzymes #3,#4,#13 et la

constante λ des enzymes #3,#4

ˆ 819 mM d’hydrog`ene en modifiant la concentration E0 des enzymes #3,#4,#13 et les

Discussion

Param`etre modifi´e optimum [H₂] (mM) optimum [H₂] (mM) avec l’ensemble minimal

E0 591 582 kcat 810 799 Km 238 236 lambda 118 118 E0+ λ 815 793 E0+ Km 827 819

Table 2.9: R´ecapitulatif des diff´erentes optimisations.

Nous avons pu obtenir comme meilleure production : 810 mM d’hydrog`ene avec la modifica- tion simple sur kcat et 827 mM avec la modification double sur E0 et le Km (voir table2.9).

Nous avons pu obtenir plus de 95% du rendement maximal th´eorique via ces optimisations. Notre ´etude montre aussi l’influence des r´eactions limitantes lors de la s´election de l’ensemble minimal. En effet, chacune des variables de ces ensembles est associ´ee `a une r´eaction limi- tante. Le rep´erage des r´eactions limitantes pr´esente donc un int´erˆet lors de l’optimisation afin d’avoir le meilleur rendement en modifiant le moins possible de variable dans le syst`eme. Ces r´eactions sont celles effectu´ees par les enzymes : E3 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), E4 (6-phosphogluconic dehydrogenase) et comme attendu E13 (NADP + dependent hydrogen dehydrogenase).

Au niveau des param`etres cibles, le kcat est celui pr´esentant le plus d’int´erˆet lors des optimi- sations. La modification seule de Km ou de λ pr´esentent un faible int´erˆet dans l’am´elioration du rendement du syst`eme. Cependant leur modification en synergie avec celle de E0 est tr`es

b´en´efique. Nous avons abouti `a un r´esultat proche voir meilleur que l’optimisation reposant uniquement sur le kcat. Le choix du param`etre `a modifier d´ependra finalement du champs d’action exp´erimentale. Est-il plus facile d’obtenir des enzymes ayant des valeurs sp´ecifiques pour Km ? Ou pour kcat ? Ou pour λ ?. La r´eponse d´ependra des enzymes ´etudi´ees, sachant qu’en utilisant les ensembles minimaux le syst`eme doit ˆetre modifi´e pour 2 enzymes avec Km et lambda et 3 enzymes avec kcat.

Durant les diff´erentes optimisations nous avons aussi observ´e la cin´etique de concentration d’hydrog`ene et sa vitesse de production dans le temps, voir figure2.9. Comme il ´etait attendu, la meilleur vitesse de production a ´et´e obtenue lors de l’optimisation selon kcat. La vitesse initiale, `a t=0, est de 2,6 mmol.L1_.min1 _H

2. Les optimisations doubles, E0 + λ et E0 +

Km, comme nous l’avons d´ej`a dit donnent une concentration finale d’hydrog`ene proche voir meilleur que l’optimisation simple avec kcat(figure 2.9). Mais leur cin´etique est diff´erente de celle de kcat(figure2.9). Pour des temps de production courts, inf´erieur `a 2500 min, en terme de concentration final d’hydrog`ene, il est plus avantageux d’utiliser l’optimisation simple avec kcat du fait de la forte vitesse initiale de production dans ce cas. Pour des temps de production plus grand, la concentration finale en hydrog`ene est proche entre les optimisations doubles et l’optimisation avec kcat.

Comme ´enonc´e pr´ec´edemment, la modification via E0 est la plus facile `a reproduire

exp´erimentalement car elle ne n´ecessite pas de modification g´en´etique d’enzymes, E0 est

plutˆot un param`etre de condition exp´erimentale qu’un param`etre intrins`eque `a l’enzyme. Il existe ´evidemment d’autres param`etres exp´erimentaux, telles que la pression et la temp´erature, que nous aurions pu modifier pour essayer d’optimiser le syst`eme. Ces param`etres ne sont pas repr´esent´es directement dans le mod`ele mais ils sont int´egr´es dans les lois cin´etiques des r´eactions. En effet, les param`etres cin´etiques d’une enzyme, comme kcat, Km, λ, sont d´etermin´es dans des conditions exp´erimentales pr´ecises. Ainsi dans le syst`eme initial les valeurs des param`etres ont ´et´e d´etermin´ees pour une temp´erature de 32°C et une pression ambiante. Si nous voulons optimiser le syst`eme selon la temp´erature cela revient `a modifier et `

a avoir les param`etres cin´etiques des enzymes associ´ees `a diff´erentes temp´eratures. La prise en compte directe des conditions exp´erimentales n´ecessiterait de modifier le mod`ele pour int´egrer des param`etres directement li´es `a ces conditions et de modifier les lois cin´etiques en fonctions de ces param`etres.

Ces travaux r´ev`elent, in silico, les valeurs de param`etres `a obtenir pour am´eliorer le syst`eme. Pour obtenir in vivo de telles enzymes, il faudra avoir recours `a l’ing´enierie des prot´eines pour g´en´erer et cribler les enzymes id´eales. Les ensembles minimaux permettent de r´eduire cette phase en ne ciblant uniquement que les enzymes les plus pertinentes pour avoir une optimisation correcte. La g´en´eration de telles enzymes sera extrˆemement vari´ee en terme de complexit´e et de difficult´e selon l’enzyme de base et rel`eve du domaine de l’ing´enierie prot´eique.

Les enzymes `a g´en´erer peuvent ˆetre consid´er´ees comme des mutants des enzymes du syst`eme initiale.

0 200 400 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) E0 : H2 concentration 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate (mmol/L/min) E0 : H2 rate 0 30 60 90 120 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) degradation : H2 concentration 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate (mmol/L/min) degradation : H2 rate 0 50 100 150 200 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) km : H2 concentration 0.00 0.02 0.04 0.06 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate (mmol/L/min) km : H2 rate 0 200 400 600 800 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) kcat : H2 concentration 0 1 2 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate (mmol/L/min) kcat : H2 rate 0 200 400 600 800 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) E0+degradation : H2 concentration 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate (mmol/L/min) E0+degradation : H2 rate 0 200 400 600 800 0 2500 5000 7500 Time(min) Concentr ation(mM) E0+km : H2 concentration 0.0 0.2 0.4 0.6 0 2500 5000 7500 Time(min) H2 r ate(mmol/L/min) E0+km : H2 rate

Figure 2.9: Suivi de la concentration de H2(gauche) et de vitesse de production(droite) dans

Bien que la g´en´eration de mutants avec des caract´eristiques pr´ecises ne soit pas ´evidente, la g´en´eration en elle-mˆeme de mutants aux propri´et´es inconnues est facile. Une phase de cri- blage est effectu´ee sur ces mutants pour conserver ceux ayant les caract´eristiques souhait´ees. Nous avons essay´e de d´eterminer in silico les propri´et´es cin´etiques de ces mutants avec le mod`ele.