D´ etermination des param` etres cin´ etiques de mutants

Le but de ce travail est d’instaurer une d´emarche autorisant le criblage des param`etres d’un mutant. Nous n’avons pour le moment pas de moyen in silico de pr´edire les param`etres de chaque type d’enzyme appartenant au syst`eme, par la lecture directe de la s´equence primaire. Nous nous sommes donc orient´e vers une approche empirique pour cette ´etude ; o`u `a partir de donn´ees g´en´er´ees in silico nous avons assembl´e une base d’estimation des diff´erents pa- ram`etres.

A partir du mod`ele nous pouvons faire varier les param`etres cin´etiques `a souhait. Diff´erents comportements d’enzymes ont pu ˆetre produits en ´evaluant diff´erentes valeurs de param`etres. Ces comportements peuvent ˆetre ensuite associ´es aux diff´erentes valeurs de param`etres. Nous avons choisi dans notre ´etude de suivre les comportements des enzymes sur la production d’hydrog`ene par le syst`eme. La production en hydrog`ene est facilement mesur´e `a partir des simulations et des exp´eriences. Il existe ´evidemment bien d’autres comportements associ´ees aux enzymes tels que la variation de concentration de chacun des m´etabolites. Cependant nous avons choisi le suivi de la production de l’hydrog`ene car cette indication est le param`etre de sortie dans les conditions exp´erimentales. En effet le relev´e des concentrations de tous les r´eactifs interm´ediaires du syst`eme est difficilement envisageable exp´erimentalement.

Nous avons enregistr´e l’effet de la variation de ces param`etres sur la production en hydrog`ene du syst`eme. Nous avons, en particulier, relev´e les pentes associ´ees `a ces variations (voir figure

2.10). La pente est la vitesse initiale `a t=0 de la r´eaction et une donn´ee facilement accessible in silico et in vivo pour caract´eriser la cin´etique de production en hydrog`ene. L’autre mesure facilement r´ecup´erable pour d´ecrire cette production est le plateau du syst`eme (voir figure

Figure 2.10: Repr´esentation de la pente et du plateau.

Le but est de constituer une base, `a partir du mod`ele analytique, associant une valeur d’un param`etre cin´etique `a une pente donn´ee ou un plateau donn´e. L’utilisation de cette base n´ecessiterait d’avoir un r´esultat exp´erimental au pr´ealable indiquant la pente ou le plateau de la production d’H2 dans un syst`eme employant ce mutant.

Cette base servirait pour l’estimation d’un param`etre en fonction de la pente et du plateau obtenus exp´erimentalement dans un syst`eme utilisant tout type de mutant.

Avant d’arriver `a ce cas de figure id´eale, la base a ´et´e construite, analys´ee afin de d´eterminer si un param`etre pouvait ˆetre pr´edit en fonction de la pente ou du plateau.

Nous avons cherch´e `a construire une base afin de pr´edire le kcat et Km des mutants de chaque enzyme du syst`eme. Nous avons introduit dans le mod`ele diff´erentes valeurs d’un param`etre, kcat ou Km, afin d’obtenir une simulations de la cin´etique de l’hydrog`ene pour chacune de ces valeurs. Dans nos simulations, nous avons test´e l’ajout d’un seul mutant `a la fois, donc une seule enzyme est modifi´ee dans le syst`eme dans chaque simulation. Les param`etres des autres enzymes sont les mˆemes que dans le syst`eme de base. Ces simulations nous ont fourni des valeurs de pente ou de plateau associ´ees avec les diff´erentes valeurs du param`etre ´etudi´e.

Pour ces simulations nous avons d’abord calibr´e le syst`eme dans les conditions ´enonc´ees dans la section ult´erieur 2.2.1. Nous avons fait varier la constante kcat ou Km selon les bornes indiqu´ees dans la section2.2.2.

En introduisant une seule enzyme mutante `a la fois, dans le syst`eme de base, nous avons pu ´etablir une relation entre la valeur du kcat et la vitesse initiale du syst`eme uniquement pour certaines enzymes : les enzymes #1 `a #3, #13 ( voir figure 2.11). En modifiant leur valeur de kcat, la pente a ´et´e aussi modifi´ee. Dans le cas des autres enzymes, la figure 2.11

montre peu de variation de la vitesse initiale du syst`eme quelque soit la valeur adopt´ee par le kcat. Le kcat de ses enzyme a peu d’impact sur la pente. L’analyse selon le plateau expose des relations suppl´ementaires. Une modification du kcat alt`ere la valeur du plateau pour les enzymes #1 `a #4 et #13 (voir figure2.12). Ainsi avec la configuration de d´epart du mod`ele, la base peut ˆetre utilis´ee afin de formuler des fonctions de pr´ediction du kcat en fonction de la pente ou du plateau pour les enzymes #1-4, #13.

L’´etablissement d’une base pour d´eterminer le Km a donn´e peu de r´esultats(figures 2.13,

2.14, 2.15, 2.16). Sur l’ensemble des param`etres, seul le Km pour le NADPH de l’enzyme #13 a vraiment une cons´equence notable sur la production d’hydrog`ene tant au niveau de la pente qu’au niveau du plateau.

`

A partir du mod`ele initial, notre d´emarche peut ˆetre utilis´ee pour estimer des kcat en relevant la valeur de la pente `a t=0 ou celle du plateau. L’estimation ne peut pas se faire sur toutes les enzymes du syst`eme. N´eanmoins, elle peut pr´edire les param`etres pour les enzymes #3, #4 et #13 qui sont celles appartenant `a l’ensemble minimal ´etabli dans la section 2.2.3 et indiquant les enzymes avec le plus d’influence dans les optimisations selon le kcat.

`

A partir de cette estimation de param`etre, des enzymes#3, #4 et #13, nous pouvons d´ecrire le comportement du syst`eme en int´egrant cette valeur dans le mod`ele analytique construit pr´ec´edemment.

Cette d´emarche ne permet pas l’introduction de mutants de diff´erentes enzymes `a la fois. Si un deuxi`eme mutant est ajout´e au niveau d’une autre enzyme, une nouvelle base d’estimation devra ˆetre construite en prenant le syst`eme ayant le premier mutant comme point de d´epart. Nous aurions pu ´etablir des bases pour visualiser les modifications des param`etres sur la cin´etique de la r´eaction de l’enzyme mˆeme et non pas sur la cin´etique et la production globale d’hydrog`ene du syst`eme enzymatique. Ces bases auraient pu contribuer `a l’estima- tion de la valeur du param`etre en fonction du d´eroulement de la r´eaction. Mais, comme d´ej`a ´enonc´e pr´ec´edemment, le suivi de chaque r´eaction est tr`es difficile `a mettre en place exp´erimentalement dans un syst`eme compos´e de 13 enzymes.

OPTIMISA TION IN SILICO DU SYST `EME ENZYMA TIQUE 71

Figure 2.11: Suivi de la pente en fonction du kcat. 1/Pente en fonction de 1/kcat. Les pentes ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

CHAPITRE 2. MOD ´ELISA TION ANAL YTIQUE D’UN SYST `EME A CELLUAIRE DE BIOTRANSF ORMA TION DE POL YSA CCHARIDE EN HYDR OG `ENE

Figure 2.12: Suivi du plateau en fonction du kcat. 1/Plateau en fonction de 1/kcat. Les plateaux ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

OPTIMISA TION IN SILICO DU SYST `EME ENZYMA TIQUE 73

Figure 2.13: Suivi de la pente en fonction du Km.1/Pente en fonction de 1/Km. Les pentes ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

CHAPITRE 2. MOD ´ELISA TION ANAL YTIQUE D’UN SYST `EME A CELLUAIRE DE BIOTRANSF ORMA TION DE POL YSA CCHARIDE EN HYDR OG `ENE

Figure 2.14: Suivi de la pente en fonction du Km.1/Pente en fonction de 1/Km. Les pentes ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

OPTIMISA TION IN SILICO DU SYST `EME ENZYMA TIQUE 75

Figure 2.15: Suivi du plateau en fonction du Km.1/Plateau en fonction de 1/Km. Les pentes ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

CHAPITRE 2. MOD ´ELISA TION ANAL YTIQUE D’UN SYST `EME A CELLUAIRE DE BIOTRANSF ORMA TION DE POL YSA CCHARIDE EN HYDR OG `ENE

Figure 2.16: Suivi du plateau en fonction du Km.1/Plateau en fonction de 1/Km. Les pentes ont ´et´e relev´ees pour plu- sieurs concentrations initiales de l’enzyme modifi´ee : vert=5U/mL, rouge=8.75U/mL, orange=12.5U/mL, marron=16.25U/mL, bleu=20U/mL.

Cependant, cette d´emarche de criblage n’est pas la solution id´eale, elle requiert au pr´ealable d’effectuer une exp´erimentation pour obtenir la production d’hydrog`ene en introduisant un mutant dans le syst`eme de base. Ce criblage in silico devrait ˆetre aussi utilis´e apr`es l’´evaluation du mutant au niveau du syst`eme de production. Si un mutant est int´eressant pour de la production globale et la cin´etique globale, il est alors possible avec notre d´emarche in silico d’estimer les param`etres de ce mutant.

L’ensemble des travaux d’optimisation, ´enonc´es pr´ec´edemment, nous a aiguill´e vers diff´erentes pistes pour am´eliorer le rendement en hydrog`ene du syst`eme. Nous avons pr´esent´e les enzymes les plus importantes `a modifier lors de l’exposition des ensembles minimaux d’optimisation, les enzymes #3, #4 et #13. Justement pour ces enzymes, nos travaux peuvent servir `a identifier le kcat des mutants, lors de l’introduction d’un seul mutant dans le syst`eme et par la lecture de pente apr`es un cycle de production. Ces r´esultats ont ´et´e obtenus suite `a la construction d’un mod`ele de connaissance. Sans les informations sur les diff´erents m´ecanismes cin´etiques intervenant dans le syst`eme, une mod´elisation selon l’approche analytique est difficilement r´ealisable. Une autre approche de mod´elisation peut ˆetre employ´ee dans ce cas, la mod´elisation syst´emique.

Mod´elisation syst´emique d’un syst`eme

acelluaire de biotransformation de

3.1

Contexte

Nous avons comme point de d´epart un mod`ele de connaissance repr´esentant un syst`eme synth´etique produisant l’hydrog`ene dans un milieu acellulaire. Ce mod`ele repose sur la connaissance approfondie de la cin´etique de chaque enzyme du syst`eme. Ainsi, la construction du mod`ele de connaissance a n´ecessit´e une recherche exhaustive de la cin´etique de chaque enzyme. Selon le syst`eme `a mod´eliser, cette ´etape essentielle n’est pas forc´ement r´ealisable par le manque d’informations au niveau des enzymes. Alors, la mod´elisation du syst`eme est alors difficilement possible avec cette m´ethode.

Le mod`ele d´ecrit dans le chapitre 2 est propre au syst`eme `a 13 enzymes de Ye et al.. Si un nouveau syst`eme synth´etique de production d’hydrog`ene, avec de nouvelles enzymes et de nouveaux substrats, est mis en place, l’objectif est de pouvoir le mod´eliser mˆeme si la cin´etique des enzymes demeure inconnue. Ainsi le but de cette ´etude est de valider un pro- tocole permettant de mod´eliser le comportement d’un syst`eme m´etabolique sans connaitre les diff´erents m´ecanismes de fonctionnement intrins`eques au syst`eme enzymatique. Une ap- proche de type pr´edictive a donc ´et´e envisag´ee. Cette m´ethodologie n´ecessite des bases de donn´ees riches en informations. L’identification du mod`ele est alors r´ealis´ee `a partir de ces bases de donn´ees.

Le mod`ele pr´edictif, `a identifier, est de type r´eseau de neurones qui est reconnu pour sa capacit´e `a mod´eliser des syst`emes non-lin´eaires. Le mod`ele identifi´e doit pouvoir pr´edire, avec pr´ecision, le comportement dynamique du syst`eme enzymatique `a partir des valeurs de concentrations initiales des substrats et des enzymes. Le comportement type du syst`eme, utilisant ces concentrations initiales, est caract´eris´e par la pr´ediction des sorties suivante du syst`eme :

ˆ la pente `a t=0 du syst`eme au niveau de la courbe de concentration d’hydrog`ene dans le temps.

ˆ la concentration d’hydrog`ene atteinte au plateau.

En s’appuyant sur ce protocole, il est possible, `a partir des concentrations initiales, donn´ees normalement accessibles, d’obtenir une estimation de la vitesse maximale de production du syst`eme, et du seuil maximal d’hydrog`ene produit par le syst`eme m´etabolique.

Figure 3.1: Repr´esentation de la pente et du plateau.