W ESTERN BLOT

P

Les extraits d’hypothalamus ou de foie sont broyés par action mécanique, à l’aide de billes en acier inoxydable, dans 1 ml de tampon de lyse grâce à un TissueLyser II (Qiagen). Ce tampon de lyse se compose de 250 mM de sucrose, 20 mM d’Hépès, 2 mM d’EGTA, 3 mM d’azide de sodium, d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Sigma Aldrich). Une fois broyés, les tissus sont centrifugés à 2000 tr/min pendant cinq minutes à 4°C. Les cellules sont quant à elles rincées avec du PBS 10 mM et grattées dans 100 µl de tampon de lyse. Ce dernier se compose de 100 mM de NaCl, 1% de NP40, d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Sigma Aldrich). Les suspensions obtenues sont ensuite centrifugées à 13 000 tr/min, à 4°C pendant cinq minutes. Les surnageants sont récupérés puis stockés à - 20°C en vue de leur dosage puis de leur analyse par Western Blot.

S

SDSPAGE

Après dosage protéique, les échantillons sont dénaturés et séparés en conditions dénaturantes sur un gel de poly-acrylamide de 10 % (acrylamide 10%, Tris 1M, pH 8.8, SDS 10% ; tampon de migration : Tris 25 mM, glycine 200 mM, SDS 0,1%, pH 8,3 (BioRad)). La migration est effectuée à 400 mA pendant 1 h, elle est contrôlée avec la migration de marqueurs de poids moléculaires pré-colorés (BioRad).

T

Le transfert des protéines est effectué à sec (iBlot™ Gel Transfer Device, Invitrogen) sur une membrane de nitrocellulose pendant sept minutes.

I

-

Les membranes sont ensuite saturées pendant une heure à température ambiante dans du TBS-T (pour un litre : 9g de NaCl, 3g de Trisma base, 0,5% Tween20) contenant 5% de BSA. Les membranes sont ensuite incubées pendant une nuit à 4°C en présence d’un anticorps primaire polyclonal (Tableau 3). Le lendemain, les membranes sont incubées avec un anticorps secondaire. La présence des protéines d’intérêt est révélée par ECL (Pierce) et visualisée grâce à l’appareil « Las4000 » [Fujifilm].

Anticorps Dilution Espèce

p-Akt (Thr 308) 1/1000 Rabbit p-Akt (Ser 473) 1/1000 Rabbit

Akt 1/1000 Rabbit p-PKC ζ (Thr 410/403) 1/1000 Rabbit PKC ζ 1/1000 Rabbit HA-PKC ζ 1/20 000 Mouse SPT2 1/1000 Rabbit β Actine 1/10 000 Mouse

Tableau 3 : Liste des différents anticorps utilisés ainsi que leur dilution.

MISE EN EVIDENCE DES ARN MESSAGERS PAR RTQ-PCR

EN TEMPS REEL

Les extractions d’ARN ont été réalisées à l’aide du kit RNeasy Lipid Tissue Mini (QIAGEN). La synthèse des ADN complémentaires (cDNA) a été faite par Reverse Transcription ARNm. Nous avons utilisé 40ng de cDNA comme matrice pour chaque réaction. Les réactions d’amplification par PCR quantitative en temps réel ont été effectuées dans un système de détection LightCycler 1.5 (Roche) à l’aide du kit LightCyclerFastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). Les conditions de PCR étaient les suivantes : 95°C pendant 10 min (hot start pour activer la Taq), suivie de 40 cycles de 95°C pendant 10 secondes, 60°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 secondes. Le mix réactionnel utilisé est composé de master mix (dNTP, SYBR Green I, Taq polymérase et tampon), d’amorces sens et anti sens, de MgCl2, d’H2O et de cDNA. Enfin, les résultats ont été normalisés par le gène RpL19, un gène de référence dit constitutif et non régulé par les conditions expérimentales. (Tableau 4)

Rat Souris

Oligoname Séquences Oligoname Séquence

CerS1_r_S CGGGAATACGACAGTCTGG CerS1_m_S GGAGCTACTGCGCTTACCTG

CerS1_r_AS CACCAGGCCATTCCTTAGAG CerS1_m_AS CCATGCCTGACCTCCAGT

CerS2_r_S ACCGGTCAGCTTTGCACT CerS2_m_S AGAAGTGGGAAACGGAGTAGC

CerS2_r_AS CGTTCCCACCAGAACTAGTCA CerS2_m_AS TTCCCACCAGAAGTAGTCATACAA

CerS3_r_S GCTGGCGATTTACATTCTATTTC CerS3_m_S GGCGATTTACATTTTACTTGCTG

CerS3_r_AS GGTCGTATGCCCATGGTTTA CerS3_m_AS TCATATGCCCATGGTTTGTC

CerS4_r_S TGAAGCAGAGACCAGTGGAG CerS4_m_S TTCCCAGTGGCTCTGGTC

CerS4_r_AS AATCTGCCGCAACGTGAG CerS4_m_AS GGCAAGGCCACAAATCTCT

CerS5_r_S GACAGTCCCATCCTCTGCAT CerS5_m_S CATGCCATCTGGTCCTACCT

CerS5_r_AS TGTTCGTGTGTGTGGCTCA CerS5_m_AS GCGGTCATCCTTAGACACCT

CerS6_r_S TGGTTTCGACAAAGGCGTA CerS6_m_S GGAGCTCGTCATTTTATTGGTCTTT

CerS6_r_AS AGAGGTAAAAGGAAAATCTCCACA CerS6_m_AS GGAACATAATGCCGAAGTCC

SPT1_r_S CTCAGGCACGCTACTTGGAC SPT1_m_S GGTGCTGGTGGAGATGGT

SPT1_r_AS GGTGACCACAACCCTGATG SPT1_m_AS GGATTCCTTCCAAAATAAGATGG

SPT2_r_S GGATGGCACCAGTCTTGG SPT2_m_S TCGGTGCTTCAGGAGGATAC

SPT2_r_AS TCATTGCCATAGATGATGAACC SPT2_m_AS GAGAATGTGTGCGCAGGTAG

rpL19_r_S CCACAAACTGAAGGCAG rpL19_m_S CCACAAGCTTTTCCTTTCG

rpL19_r_AS CTCCTTGGACAGAGTCTT rpL19_m_AS GGATCCAACCAGACCTTCTTT

Tableau 4 : Liste des différents primers utilisés.

DOSAGE DES SPHINGOLIPIDES

D

DAGK

Les concentrations de céramides dans les extraits de lipides cellulaires sont mesurées par la méthode enzymatique de la DAG kinase (Le Stunff et al., 2002). Un aliquot de la phase organique est récupéré et évaporé à l’aide d’un SpeedVac. Le culot déshydraté est alors re- suspendu dans un mélange de 7,5% (m/v) d’ocyl-β-Dglucopyranoside/5 mM cardiolipine solubilisé dans 1 mM DETPAC/10 mM imidazole (pH 6,6). La réaction enzymatique commence lors de l’ajout de 20 mM DTT, 0.88 U/ml de DAGK d’E. coli, 5 µCi/10 mM [γ-

32P]ATP et le tampon de réaction (100 mM imidazole (pH 6,6), 10 mM NaCl, 25 mM MgCl2, et 2 mM EGTA). Après 1 heure d’incubation à température ambiante, la réaction est arrêtée par l’ajout de 500 µl d’un mélange CHCl3/Méthanol/HCl (100 :100 :1). La séparation des phases est effectuée par l’ajout de 100 µl de NaCl 1M. 50 µl de la phase organique sont déposés sur des plaques de silice puis séparés par chromatographie sur couche mince de silice dans le solvant composé de CHCl3/acétone/méthanol/acide acétique/H2O (10:4:3:2:1). La radioactivité associée au céramides-1-P32 est déterminée à l’aide d’un phosphoimager (FLA7000, Fuji) et quantifiée à l’aide du logiciel MultiGauge. Une gamme de céramide de cerveau de bovin (Sigma-Aldrich) est réalisée afin de déterminer la concentration en céramides dans chaque échantillon. Les résultats sont exprimés en pmol de céramides par nmol de phospholipides.

M

40 µl d’un mélange de 10N H2SO4/70% acide perchlorique (3:1, v/v) est ajouté à un aliquot de la phase organique. Le tout est incubé à 210°C pendant 2 h. Après refroidissement de l’échantillon, 75µl d'H2O est ajouté. Puis 400 µl d’un mélange de 4.2% ammonium molybdate dans de l’HCl 4N/0.045% malachite green (1:3 v/v) est ajouté et l’ensemble est incubé à 37°C pendant 30 minutes. L’absorbance est mesurée à 660 nm.

M

Tous les lipides ont été extraits selon la méthode de Folch et al., (Folch et al., 1957). Les différentes espèces de céramides ont été récupérées (phase organique) et analysées à l’aide d’une approche lipidomique non ciblée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC–HRMS) comme décrit dans l’article (Seyer et al., 2016). Les données de la spectrométrie de masse sont analysées à l’aide du logiciel XCMS (https://metlin.scripps.edu/).

VIABILITE CELLULAIRE

Le nombre de cellules vivantes présentes dans chaque puits est mesuré à l’aide d’un test MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Le principe de ce test est basé sur la capacité des cellules vivantes à réduire le MTT grâce à leur activité succinate déshydrogénase mitochondriale. En pratique, à la fin du traitement, du MTT est ajouté (5mg/ml) puis les cellules sont remises à l’incubateur à 37°C dans une atmosphère humide (5% CO2, 95% O2) pendant deux heures. Le milieu de culture sera aspiré et 100 µl de

DMSO sera ensuite ajouté. Après vingt minutes, la densité optique de chaque puits sera lue à une longueur d’onde égale à 560 nm à l’aide d’un lecteur de plaque Tecan (NanoQuant PlateTM_).

MESURE DE LA MASSE BETA-PANCREATIQUE

Après récupération, les pancréas ont été immergés dans une solution de formaline puis incorporés dans de la paraffine. Des sections de 4 µm d’épaisseur ont été traités pour l’immunohistochimie comme décrit précédemment (Rachdi et al., 2003). Des anticorps ont été utilisés à différentes dilutions : mouse anti-insulin (1:2000; Sigma); rabbit anti-insulin (1:2000; Dako). Les anticorps secondaires fluorescents proviennent de Jackson ImmunoResearch. Les noyaux ont été colorés grâce au colorant fluorescent Hoechst 33342 (0,3 mg/ml ; Invitrogen). Les sections ont été numérisées à l’aide de caméras 3-CCD froides (C5810 or C7780; Hamamatsu) qui sont reliées à un microscope à fluorescence (Leitz DMRB; Leia). La quantification du marquage de l’insuline a été effectuée sur cinq sections différentes du pancréas. Pour chaque section, l’aire de la cellule β et l’aire du pancréas ont été déterminées grâce au logiciel NIH ImageJ software (v1.31; http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Pour les pancréas, le pourcentage de l’aire des cellules β a été déterminé pour chaque section en divisant l’aire totale des cellules positives pour le marquage à l’insuline par la surface de la section. La masse β-cellulaire a quant à elle été calculée en multipliant le poids du pancréas total avant inclusion par le pourcentage de l’aire des cellules β-pancréatiques.

ANALYSE STATISTIQUE

Les résultats sont exprimés sous forme de moyennes + /- écart-types. En fonction du nombre d’échantillons, l’analyse statistique se base sur un test one way ou two way ANOVA avec un post-test Bonferroni. p<0,05 a été considéré comme étant significatif.