Fonctions et effets physiologiques du microbiote intestinal 2.3
2.3.3 Effets trophiques et sur la motricité
Les animaux élevés sans germe (dans des contextes d‘expérimentations) ont une paroi intestinale peu trophique, un système immunitaire local très peu développé et des troubles de la motricité. Des effets trophiques et moteurs de diverses bactéries intestinales et probiotiques ont été observés dans des conditions expérimentales y compris chez l‘homme [15].
3. Méthodes d’étude du microbiote intestinal
Plusieurs méthodes existent pour caractériser le microbiote, chacune ayant des avantages et des inconvénients propres (Tableau 4). Jusqu‘à la fin du XXe siècle, la composition du microbiote intestinal était étudiée uniquement par les techniques bactériologiques classiques fondées sur la culture sur différents milieux dans des atmosphères variées.
Ces techniques permettent l‘étude des populations cultivables, qu‘elles soient dominantes ou sous-dominantes, grâce à l‘utilisation de milieux sélectifs. Elles ont une très bonne sensibilité avec un seuil de détection d‘environ 102
UFC/g (unités formant colonie/g) de selles et sont encore très largement utilisées dans les laboratoires. En revanche, elles ne permettent pas de caractériser de façon précise le microbiote, celui-ci étant composé en grande majorité d‘espèces non cultivables [25].
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Tableau 4: Effets et fonctions du microbiote intestinal [25].
Méthode Principe Avantages Inconvénients Culture classique Culture des selles sur différents
milieux dans des atmosphères variées
-Technique simple et peu coûteuse
-Bonne sensibilité : seuil de détection estimé 102 UFC/g de selles
-Culture difficile des bactéries anaérobies strictes -Caractérisation très imprécise du microbiote, composé de 80 % d‘espèces non cultivables -Pas de caractérisation des fonctions du microbiote
Culturomique Culture des selles dans plusieurs centaines de conditions différentes faisant varier les milieux et les atmosphères, suivie de l‘identification de toutes les
colonies isolées par spectrométrie de masse MALDI-TOF
-Meilleure appréciation de la diversité du microbiote que la culture classique -Identification de nouvelles espèces bactériennes
-Bonne sensibilité : seuil de détection estimé 102 UFC/g de selles
-Travail considérable de culture et d‘identification de milliers de colonies
-Culture impossible des bactéries anaérobies strictes -Pas de caractérisation des fonctions du microbiote
16S profiling Amplification par PCR et
séquençage du gène de l‘ADNr 16S à partir d‘un extrait d‘ADN total d‘un échantillon de selles
-Coût modéré
-Meilleure caractérisation de la composition et de la diversité du microbiote que la culture classique ou la culturomique
-Biais liés à l‘amplification
-Identification le plus souvent limitée au genre -Pas de caractérisation des fonctions du microbiote -Sensibilité médiocre : seuil de détection estimé 106 UFC/g de selles
-Biais liés à la phase préanalytique
Métagénomique « shotgun »
Séquençage direct de l‘ensemble de l‘ADN extrait d‘un échantillon de selles, sans étape d‘amplification
-Caractérisation la plus juste de la composition et de la diversité du microbiote
-Caractérisation des fonctions du microbiote
-Coût élevé
-Stockage et analyse coûteuse en ressources informatiques
-Sensibilité médiocre : seuil de détection estimé 106 UFC/g de selles
-Biais liés à la phase
UFC : unité formant colonie ; MALDI-TOF : matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight ; PCR : polymerase chain reaction ; ADN : acide désoxyribonucléique ; ADNr : acide désoxyribonucléique ribosomique.
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La technique de « culturomique », fondée sur l‘association de la culture des selles sur des milieux et dans des atmosphères variées avec l‘identification de toutes les colonies isolées par spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionisation-time of
flight), permet de mieux apprécier la diversité du microbiote. En effet, lors de l‘étude du
microbiote de volontaires ou de patients, cette technique a permis d‘identifier de nombreuses espèces bactériennes qui n‘avaient jamais été décrites dans le microbiote humain, dont 90 nouvelles espèces bactériennes. Cependant, l‘utilisation de la « culturomique » est limitée par le travail substantiel que représentent la culture dans plusieurs centaines de conditions différentes et l‘identification des milliers de colonies isolées. De plus, malgré les efforts d‘optimisation des conditions de transport et de culture des prélèvements en anaérobiose, un grand nombre de bactéries anaérobies strictes restent non cultivables. On estime en effet qu‘environ 80 % des espèces identifiées dans le microbiote intestinal par les outils moléculaires n‘ont jamais été cultivées.
L‘étude du microbiote intestinal a donc largement bénéficié du développement de méthodes indépendantes de la culture, et les progrès spectaculaires, au cours de la dernière décennie, des technologies de séquençage ont permis une meilleure caractérisation de la composition et de la diversité du microbiote à travers le développement de la métagénomique. La détermination de la composition du microbiote par les outils moléculaires peut ainsi être effectuée par l‘analyse du gène de l‘ADNr (acide désoxyribonucléique ribosomique) 16S après son amplification par biologie moléculaire à partir d‘un extrait d‘ADN total d‘un échantillon de selles.
Le gène de l‘ADNr 16S est en effet présent chez toutes les bactéries, avec des régions conservées et des régions hypervariables spécifiques à chaque espèce bactérienne. Si cette méthode est aujourd‘hui peu onéreuse, elle peut souffrir de biais importants liés à sa phase préanalytique (notamment amplification et préparation des librairies lors du multiplexage). Plusieurs études ont ainsi montré que l‘abondance relative des différents phyla ou la détection de certains genres dépendaient de la région amplifiée. L‘alternative (dite métagénomique « shotgun » ou métagénomique par séquençage direct), plus juste mais plus coûteuse, consiste à séquencer directement l‘ensemble de l‘ADN d‘un échantillon, sans étape d‘amplification. Elle permet donc une analyse taxonomique (par exemple en sélectionnant les gènes de l‘ADNr
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16S ou en utilisant des méthodes fondées sur l‘indexation des motifs [k-mers]), mais également une analyse des fonctions du microbiote. En effet, l‘analyse bio-informatique de l‘ensemble des séquences d‘ADN générées et la comparaison aux bases de données permettent de définir la fonction des gènes séquencés et, par conséquent, la proportion de chaque voie métabolique. Il est en revanche important de noter que ces techniques indépendantes de la culture souffrent d‘un manque de sensibilité. La profondeur d‘analyse actuelle de la métagénomique ne permet en effet de détecter que les micro-organismes dominants, avec un seuil de détection estimé à 106 UFC/g de selles, soit un nombre 10 000 fois plus faible que celui de la culture classique [25].
4. Microbiote et environnement
Les polluants environnementaux et alimentaires peuvent être à l‘origine d‘un déséquilibre de l‘homéostasie intestinale avec des conséquences non négligeables pour la santé.