Dosage des proanthocyanidines et de la procyanidine B1 dans les extraits d’écorces

Les extraits d’écorces de pin maritime sont connus pour contenir de nombreux polyphénols parmi lesquels les proanthocyanidines (PAs), polymères constitués de procyanidines B1 (et procyanidine B2 dans une moindre mesure), eux-mêmes dimères de catéchine et/ou d’épicatéchine (Figure III-38), qui sont réputés pour leur contribution à l’activité antioxydante de l’extrait (paragraphe III-3.2.4).

Figure III-38 : Structure chimique des molécules de catéchine, d’épicatéchine, de procyanidine B1, de procyanidine B2 et une partie d’un polymère de proanthocyanidine

En particulier, le test de Porter (Porter et al., 1986) permet d’évaluer la quantité de proanthocyanidines extraites à l’aide d’une hydrolyse acide, en utilisant la procyanidine B2 comme étalon. Les rendements en proanthocyanidines sont exprimés en Equivalent Procyanidine B2 (EPB2). Appliquée aux extraits obtenus en appareil de Soxhlet à l’eau, à l’éthanol et au méthanol (Tableau III-57), cette méthode montre que :

- avec l’eau, pour laquelle le rendement d’extraction est faible (1,55 g d’extractibles et 0,29 g EAG de polyphénols par 100 g de matière sèche traitée, Tableau II-11), pratiquement aucune trace de proanthocyanidine n’est détectée dans l’extrait.

- par contre, le méthanol et l’éthanol conduisent à des rendements en proanthocyanidines de 0,9 g EPB2 par 100 g de matière sèche, pour des rendements en extractibles respectifs de 9,1 et 9,5 g par 100 g de matière sèche et en polyphénols respectifs de 1,6 et 2,0 g EAG par 100 g de matière sèche.

Ces résultats sont confirmés par le dosage de la procyanidine B1, dimère constitutif des proanthocyanidines d’écorces de pin maritime mais également présent à l’état libre dans ces écorces, dans les extraits par Chromatographie Liquide à Haute Performance couplée à un Spectromètre de Masse (HPLC-MS). La présence de ce composé dans les extraits éthanoliques et méthanoliques ainsi que son absence dans les extraits aqueux montrent que

cette molécule peut être considérée comme un traceur de l’extraction sélective des PAs, composés moyennement polaires nécessitant un solvant moins polaire que l’eau pour être extraits.

Tableau III-57 : Extraction des proanthocyanidines et de la procyanidine B1 d’écorces de pin maritime en appareil de Soxhlet à l’eau, à l’éthanol et au méthanol

Solvant d'extraction

Concentration en proanthocyanidines des extraits (mg EPB2 par g

d'extrait sec)d Rendement d'extraction en proanthocyanidines (g EPB2 par 100 g de matière sèche)d Concentration en procyanidine B1 des extraits (mg par g d'extrait sec)e Eaua traces 0 0 Ethanolb 110 ± 14 0,90 ± 0,01 72,4 ± 0,2 Méthanolc 108 ± 5 0,90 ± 0,02 81,2 ± 3,2

Conditions opératoires : extraction réalisée à l’aide d’un appareil de Soxhlet, masse de matière : 10 g frais, durée d’extraction : 6 h, répétition extraction n=3

a _{Température d’ébullition : 100°C} b _{Température d’ébullition : 65°C} c _{Température d’ébullition : 78°C}

d _{Dosage par la méthode de Porter (Porter et al., 1986), exprimé en Equivalent Procyanidine B2}

(EPB2), répétition analyse n=3

e _{Dosage par HPLC-MS, colonne apolaire, débit 0,55 mL/min, gradient d’eau + acide formique 0,25 %}

et de méthanol + d’acide formique 0,25 %, électrospray positif, tension 3 kV, Température 350°C répétition analyse n=3

Par contre, ni la catéchine, ni l’épicatéchine n’ont pu être détectées par HPLC-MS dans ces extraits obtenus en appareil Soxhlet, indiquant que les conditions opératoires ne sont pas suffisamment contraignantes pour permettre leur solvatation et/ou la lyse des procyanidines B1, qui libérerait les unités monomériques de catéchine et d’épicatéchine. Ce n’est pas le cas des extractions à l’eau subcritique menées en extracteur ASE (paragraphe II-2, Tableau II-15) pour lesquelles le dosage HPLC-MS des extraits révèle la présence de la procyanidine B1, mais aussi de la catéchine et de l’épicatéchine, en proportions variables selon la température et la pression (Tableau III-58).

Tableau III-58 : Dosage de la procyanidine B1, de la catéchine et de l’épicatéchine dans les extraits aqueux issus du plan d’expérience à l’extracteur ASE des écorces de pin maritime

T (°C) P (bars) T P procyanidine B1 des extraits Concentration en (mg par g d'extrait sec)

Concentration en catéchine des extraits (mg par g d'extrait sec)

Concentration en épicatéchine des extraits

(mg par g d'extrait sec)

200 100 1 0 0,4 ± 0,0 0,08 ± 0,00 0,00 175 150 0,5 0,866 0,8 ± 0,1 0,84 ± 0,12 0,00 125 150 -0,5 0,866 11,7 ± 0,9 4,39 ± 0,25 0,00 100 100 -1 0 58,9 ± 8,3 14,70 ± 1,2 8,44 ± 0,98 125 50 -0,5 -0,866 22,9 ± 5,2 6,29 ± 0,56 2,42 ± 0,41 175 50 0,5 -0,866 2,9 ± 0,7 2,24 ± 0,36 0,36 ± 0,07 150 100 0 0 6,6 4,49 0,39 150 100 0 0 8,4 4,10 0,43 150 100 0 0 6,5 4,88 0,44

Dosage par HPLC-MS, colonne apolaire, débit 0,55 mL/min, gradient d’eau + acide formique 0,25 % et de méthanol + d’acide formique 0,25 %, électrospray positif, tension 3 kV, Température 350°C

La concentration en procyanidine B1 des extraits, tout comme celle en catéchine et en épicatéchine décroît avec l’augmentation de la température d’extraction, de façon pratiquement indépendante de la pression (Figure III-39) à l’inverse du rendement en polyphénols (Figure II-6b), mais de la même façon que la teneur en polyphénols des extraits (Figure II-7b) et leur activité antiradicalaire (Figure II-7c).

Figure III-39 : Surfaces de réponse pour l’extraction de procyanidine B1, de catéchine et d’épicatéchine des écorces de pin maritime en eau subcritique (ASE)

Ces résultats indiquent que, dès lors que les conditions subcritiques sont atteintes pour l’eau (température supérieure à 100°C et pression supérieure à 50 bar), l’extraction sélective des PAs est favorisée à faible température, se traduisant par une libération de dimères procyanidine B1 maximale, mais aussi des unités monomériques de catéchine et d’épicatéchine. L’activité antiradicalaire des flavonols augmentant avec leur degré de polymérisation, ce qui s’explique par une plus grande délocalisation des électrons à travers les liaisons entre les monomères (de Gaulejac et al., 1999), l’activité de l’extrait est alors maximale. A 100°C et 100 bar, la concentration en PAs dans l’extrait obtenu, dosée par la méthode de Porter, est de 170 mg EPB2 par g d’extrait sec, correspondant à un rendement d’extraction en PAs de 0,36 g EPB2 par 100 g de matière sèche, soit près de 45 % des polyphénols extraits (0,8 g EAG par 100 g de matières sèche, Tableau II-15). L’augmentation de la température à 200°C d’extraction tendrait à provoquer la dégradation de la procyanidine B1, de la catéchine et de l’épicatéchine, telles que dosées par HPLC-MS. Cependant, le dosage des PAs par la méthode colorimétrique de Porter dans cet extrait conduit à une concentration de 350 mg EPB1 par g d’extrait sec, supérieure à la concentration en polyphénols dosés par la méthode colorimétrique de Folin-Ciocalteu (300 mg EAG par g d’extrait sec). Ce qui indiquerait que les PAs sont extraits en plus forte proportion, avec l’augmentation de la température, mais sous une forme plus dégradée, répondant toujours à la réaction colorimétrique de Porter, mais non dosable sous la forme de procyanidine B1 native. La relativement faible diminution d’activité des extraits avec l’augmentation de la température (CI50 de 5 à 14 mg/L pour une augmentation de la température de 100°C à

200°C) plaide en faveur de cette hypothèse, le rendement en PAs extraits atteignant 8,3 % de la matière sèche d’écorces de pin maritime traitées à 200°C.

Il apparait cependant que la présence de procyanidine B1 peut être considérée comme un révélateur des conditions d’extraction par l’eau à l’état subcritique.

III.3.2. Mise en évidence de la présence de la procyanidine B1 dans les