DNA-PKcs est une protéine de 469 KDa avec 4128 acides aminés, membre de la famille PI3K (phosphatidylinositol-3 kinase) qui inclus aussi ATM et ATR (Rad3- related protein) (260)(261). Des homologues de DNA-PKcs ont été identifiés dans tous les vertébrés examinés mais aucun équivalent n’a été découvert chez certains eucaryotes tels que
Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans ou Drosophila (15)(16). Les souris
dépourvues de DNA-PKcs sont viables mais présentent le phénotype SCID (severe
combined immunodeficiency) (262)(263)(264). Les cellules humaines dépourvues de
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réparation des CDBs (265). Chez l’homme une mutation non-sens de DNA-PKcs est associée au phénotype RS-SCID (RadioSensitive Severe Combined Immuno Deficiency), cette mutation n’affecte pas l’activité kinase de DNA-PK mais inhibe l’activité d’Artémis (266).
a- La fonction de DNA-PKcs
La sous-unité catalytique de DNA-PK (DNA-PKcs) interagit avec le complexe ADN-Ku et forme une holoenzyme active DNA-PK. Des essais de photo-crosslinking montrent que la fixation de DNA-PKcs au complexe ADN-Ku entraine une translocation de Ku vers l’intérieur. DNA-PKcs se fixe à environ 10 pb et se positionne à l’extrémité de l’ADN bloquant ainsi l’accès aux autres partenaires du NHEJ (135). Cette enzyme phosphoryle préférentiellement les sérines ou les thréonines suivies par une glutamine (267)(268). Même si de nombreux substrats de DNA-PK sont caractérisés incluant Ku70/80 (268),
DNA-PK elle même (269)(270), XRCC4 (271)(272)(273)(274), XLF (275), DNA Ligase
IV (276) et WRN (277), l’importance de l’activité kinase de DNA-PK dans la réparation
par la voie NHEJ est en cours de caractérisation. La phosphorylation d’un grand nombre de ces substrats ne semble pas importante pour la réparation des CDBs in vivo (275)(276)(271) à l’exception de DNA-PK elle même (278). Son autophosphorylation induit l’inhibition de l’activité kinase de DNA-PK (279)(280). L’analyse des données en SAXS montre que l’autophosphorylation de DNA-PK provoque un changement de conformation (136)(12) et une dissociation de DNA-PKcs des extrémités permettant aux autres partenaires du NHEJ d’accéder aux extrémités de l’ADN (13)(136)(137)(138). L’autophosphorylation de DNA-PKcs au niveau du cluster T2609-T2647 est aussi nécessaire pour l’activité endonucléase d’Artémis et la mise en place de la recombinaison V(D)J (281)(282). De nombreuses études ont porté sur l'impact de la phosphorylation médiée par la DNA-PKcs sur la fonction de XRCC4. Dans les cellules, XRCC4 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux traitements par RI ou par un agent inducteur de CDBs (283)(284). Plusieurs sites de phosphorylation ont été identifiés incluant Ser 260 et Ser 320 (272)(285). Cependant, l’introduction des mutants XRCC4 dépourvus de ces sites de phosphorylation permet de restaurer la radiorésistance aux RI et la recombinaison V (D) J dans les cellules XR-1 dépourvues de XRCC4 (271)(272)(285).
En dehors de sa fonction Kinase, DNA-PK peut avoir un rôle structurant lors de la réparation des CDBs par la voie NHEJ. Les deux holoenzymes DNA-PK fixées de part et d’autre de la cassure double brin peuvent interagir et former une synapse (286)(13). L’analyse des données SAXS montre que DNA-PKcs forme un dimère en solution, des
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dimères sont formés aussi en présence d’ADN et de Ku (12). Une dimérisation de DNA-PKcs est aussi observée dans la structure 3D du complexe ADN-DNA-DNA-PKcs-Ku (13). Cette synapse permettrait le rapprochement des deux extrémités d’ADN durant la réparation, évitant ainsi les remaniements génétiques et limitant la dégradation des extrémités par les nucléases (107). Contrairement à Ku, DNA-PKcs n’est pas toujours impliquée dans la réparation des CDBs (287).
En partant du principe que les CDBs réparées rapidement dans la cellule sont des CDBs simples et que les CDBs réparées tardivement sont des CDBs complexes. L’analyse en temps réel de la réparation des CDBs dans la cellule montre que les CDBs simples sont réparées rapidement en présence de Ku, XRCC4-Ligase IV et XLF. En revanche, les CDBs complexes sont réparées lentement et impliquent non seulement Ku, XRCC4, Ligase IV, XLF mais aussi DNA-PKcs (14).
b- La structure de DNA-PKcs
Le domaine N terminal de DNA-PKcs est composé de 66 répétitions de type HEAT (Hungtingtin, elongation factor3, A subunit of protein phosphatase 2A and TOR1). La région C-terminale contient un domaine FAT (FRAP, ATM, TRRAP), un domaine kinase PIKK et un domaine FATC (FAT C-terminal) (figure 10).
Figure 10 : Les domaines protéiques de DNA-PKcs
Le domaine N-ter composé de répétition de motifs HEAT s’étend du 1er au 2908eme acide aminé. Le domaine C-terminal constitué d’un domaine FAT, PIKK et FATC. En rouge les principaux sites de phosphorylation. Les résidus impliqués dans l’interaction avec Ku au niveau e l’extrémité du domaine C-ter sont indiqués en rouge. Figure adaptée de Mahaney, B.L. et al. (107).
En raison de sa taille, la cristallisation de DNA-PKcs seul ou en complexe avec ses partenaires s'est révélée difficile. Les études en Cryo-EM de DNA-PKcs montrent que les motifs HEAT forment une structure circulaire creuse, le domaine Kinase en C-ter est situé
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au sommet de cette structure (288)(289). Vu de profil, cet anneau a une forme de berceau avec une ouverture à proximité du domaine N-ter de la protéine. A l’intérieur de cette partie circulaire, se trouve un domaine globulaire de liaison à l’ADN (290) (figure 11). Le domaine Cter de DNA-PKcs permet l’interaction avec d’autres protéines incluant l’hétérodimère Ku70/Ku80 (291). Une structure cristallographique de DNA-PKcs en complexe avec la partie C-ter de Ku80 est obtenue avec une résolution de 6,6 Å. Les nombreuses répétitions HEAT hélicoïdales (motifs hélice-tourne-hélice) facilitent la flexion et permettent à la chaîne polypeptidique de se replier dans une structure circulaire creuse. Le domaine kinase C-terminal est situé au-dessus de cette structure et un petit domaine répétitif HEAT qui lie probablement l'ADN est à l'intérieur (292).
Figure 11: Structure de DNA-PKcs
Les vues de face et de profil avec des flèches bleues indiquent les sites flexibles, la structure circulaire en vert, le domaine putatif de liaison à l’ADN en violet.Les domaines FAT et FATC sont en rouge et le domaine kinase en jaune. Figures adaptée de Ochi, T et al. (256).