2- Caractérisation des interactions ADN protéines

a- Retard sur gel (EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay)

1a- principe de la méthode

Le retard sur gel est une des techniques utilisée pour caractériser les complexes ADN-protéines (425). Initialement cette approche a été utilisée pour détecter les facteurs de transcription se liant à des séquences spécifiques d’ADN (426). Elle est simple et rapide basée sur l’analyse du changement de mobilité électrophorétique de l’ADN en présence de protéine (425). La présence de la protéine ralenti la migration de l’ADN ce qui permet la séparation de l’ADN libre de l’ADN lié grâce à leurs différences de mobilité sur un gel d’électrophorèse. Si plusieurs protéines se fixent à l’ADN on observera plusieurs bandes. Depuis les années 80 de nombreuses améliorations ont été apportées à cette approche pour augmenter sa sensibilité et sa spécificité. Le marquage de l'extrémité 5 'ou 3' des acides

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nucléiques avec un radio-isotope ³²P a été largement utilisé pour sa grande sensibilité (427). Maintenant on utilise majoritairement marquage covalent de l'acide nucléique avec un fluorophore (428). Concernant les interactions ADN-protéines, il est possible d’étudier la stoechiométrie des complexes ADN-protéine, l’affinité relative d’une protéine pour différents substrats (429). Il faut noter que lorqu’une protéine P, se lie à un site unique sur une molécule d'ADN, D, on aura un complexe PD, en équilibre avec les composants libres :

Ka : taux d’association, Kd : taux de dissociation

Ce qui est étonnant et à rappeler dans les expériences de gel retard, c’est que l’équilibre est déplacé dès les premières minutes de migration puisque seuls l’ADN libre ou lié migre alors que les protéines libres ne le font pas. A priori, on ne verrait que des complexes très très stables, ce qui n’est pas toujours le cas. Pour expliquer de paradoxe, l’effet cage dans les mailles du gel ou séquestration moléculaire permettent aux protéines dissociées d’être piégées dans la maille et de revenir sur leur substrat ADN, ce qui favorise ainsi une reformation du complexe PD (430) (431).

a2- Etude de l’interaction entre XRCC4, XLF et l’ADN

L’interaction de XRCC4 et XLF avec l’ADN est caractérisée initialement sur gel retard. Les complexes ADN-protéine sont réalisés dans un volume final de 10 µl dans un tampon 10mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150mM. Une gamme de concentration (0.5 µM, 2 µM et 4 µM) est testée pour XRCC4FL et XLFFL seuls, dans le mélange équimolaire de XRCC4 et XLF on teste les concentrations suivantes 0.5 µM, 2 µM et 4 µM pour chaque protéine. Les protéines sont incubées avec 3 nM molécules d’ADN double brin linéaire 1440 pb. Après incubation 30 min à 25°C, on ajoute 2 µl de tampon de charge (6X) et on charge les échantillons sur un gel d’agarose 0,8% TBE 0,5X. La migration s’effectue dans un tampon TBE 0,5X à 90 V pendant 45 min. A la fin de la migration, le gel est coloré avec du Sybr Gold comme décrit précédemment.

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a3- Etude de l’interaction entre l’hétérodimère Ku70/Ku80 et l’ADN

Pour l’étude de l’interaction entre Ku70/Ku80 et l’ADN, j’ai utilisé un fragment d’ADN 200 pb marqué Cy5. Les complexes ADN-protéines sont réalisés dans un tampon réactionnel Tris-HCl 20 mM pH 8, NaCl 50 mM dans un volume final de 10 µl. L’hétérodimère Ku à différentes concentrations (0, 8, 16, 32, 64, 128 et 256 nM) est incubé toujours avec une concentration fixe en molécules d’ADN de 7,5 nM molécules, ce qui implique que les complexes se sont formés à différents ratio molaire extrémités d’ADN/protéine. Le mélange réactionnel est ensuite incubé 5 min ou 15 mn à 25°C à l’abri de la lumière. Après incubation on ajoute 2 µl de tampon de charge (Orange G de chez Sigma) et l’ensemble est déposé sur gels d’agarose D5 0,6 ou 0,8 % TBE 0,5X. La migration se fait à TA dans un tampon TBE 0,5X à 56mA/30 min. L’ADN marqué cy5 est révélé à l’aide d’un phosphoimageur Typhoon 7000 Fla.

b- Microscopie électronique à transmission (coloration positive)

b1- Protocole de la coloration positive

Les étapes de préparation de carbone, préparation des grilles, d’ionisation des grilles et de coloration positive sont les mêmes que celle décrites précédemment pour l’étude des complexes protéiques. La différence réside dans l’étape de préparation d’échantillons, dans ces études on forme des complexes nucléoprotéiques avant le dépot.

b2- Etude de l’interaction de XRCC4 avec l’ADN

Initialement, XRCC4FL à 250 nM est incubé 30 min à 37°C avant son utilisation pour former des complexes.

- L’ADN double brin linéaire 1440 pb à 0,5 nM molécules est incubé avec 50 nM de XRCC4FL (préalablement incubé à 37°C) dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 150 mM. Après 30 min d’incubation à 37°C, 5 µl d’échantillon sont déposés sur une grille, contrastés en coloration positive puis observés en mode fond noir annulaire.

- XRCC4FL à 50 nM (préalablement incubé à 37°C) est incubée avec 0.29 nM molécules d’ADN superenroulé négativement pUC19 dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 150 mM. Après 30 min d’incubation à 37°C, 5 µl d’échantillon sont déposés sur une grille, contrastés avec la méthode de coloration positive puis observés en mode fond noir.

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b3- Etude de l’interaction de XLF avec l’ADN

XLF à 50 nM est incubé avec l’ADN double brin linéaire 1440 pb à 0.5 nM molécules dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 150 mM. Après 30 min d’incubation à 37°C, 5 µl d’échantillon sont déposés sur une grille, contrastés avec la méthode de coloration positive puis observés en mode fond noir.

b4- Etude de l’interaction du complexe XRCC4-Ligase IV avec l’ADN

- Le complexe XRCC4-Ligase IV dé-phosphorylé à 200 nM est incubé dans le tampon A Tris HCl 10 mM pH 8, NaCl 50mM avec 2,2 nM molécules pUC19 linéarisés (2686 pb) avec l’enzyme XbaI (NEB) (les fragments obtenus ont des extrémités 4nt-5’ sortants). Après 30 min d’incubation à 30°C. Les échantillons sont dilués au 10^eme avant le dépôt sur la grille, contrastrés avec la méthode de coloration positive. Ils sont ensuite observés en fond noir.

- Différentes concentrations du complexe XRCC4-Ligase IV (50, 100, 200 et 400 nM) sont incubées avec 3 nM molécules de plasmide pUC19 linéarisé (extrémités 5’nt sortants) pendant 30 min à 37°C dans un tampon Tris HCl 10 mM pH 8, NaCl 50 mM, Mg 5 mM, ATP 1mM. Les échantillons sont dilués au 10^eme avant le dépôt sur les grilles, contrastés avec la méthode coloration positive et observés en mode fond noir filtré sur le microscope Zeiss LEO 912 AB.

b5- Etude de l’interaction de l’hétérodimère Ku70/Ku80 avec l’ADN

- Ku70/Ku80 à 50 nM est incubée avec 7,5 nM molécules d’ADN double brin linéaire 500 pb dans le tampon A Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 50 mM. Après 5 min d’incubation à 25°C, 5µl d’échantillon sont déposés sur une grille, contrastés avec la méthode de coloration positive puis observés en mode fond noir annulaire.

- Ku70/Ku80 à 24 nM est incubée avec 3 nM molécules de plasmide pUC19 linéaire avec des extrémités 5’-4 nt sortante. Après 5 min d’incubation à 25°C, 5 µl d’échantillon sont déposés sur une grille, contrastés avec la méthode de coloration positive puis observés en mode fond noir annulaire.

b6- Etude de l’interaction du complexe ADN-Ku avec XLF et XRCC4

Préparer les complexe ADNb-Ku bloqué par la streptavidine

-Dans un volume de 28 µl, 10 µM Ku70/Ku80 sont incubés avec 116 nM molécules d’ADN double brin linéaire 500pb biotinylé (ADNb). Le complexe est incubé 5 min à

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25°C dans un tampon Tris HCl 10 mM pH 8 NaCl 150 mM. Un volume de 8 µl de streptavidine fraîchement reconstituée pour avoir une concentration à 6 µM finale est ajouté au complexe et incubé 15 min à 25°C. Le complexe est dilué en ajoutant 14 µl de tampon (Tris HCl 10 mM pH 8 NaCl 150 mM) avant de les purifier sur une colonne type superose 6 préalablement équilibré avec un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 150 mM. Au cours de cette étape on élimine l’excès en protéines (Ku et streptavidine). L’analyse des fractions d’élution contenant les complexes ADNb-Ku bloqués par la streptavidine nous permet de sélectionner les fractions contenant des molécules d’ADN totalement couvertes par Ku.

La streptavidine interagit avec la biotine aux extrémités et empêche ainsi l’entrée ou la sortie des protéines Ku. L’interaction biotine streptavidine est la plus forte interaction biologique non covalente connue avec une constante de dissociation Kd de l’ordre de 4.10

-14M. La streptavidine est une protéine purifiée à partir de la bactérie Streptomyces avidini alors que la biotine est une vitamine appelée vitamine B7. La streptavidine existe sous forme d’homo-tétramères. Chaque monomère a un site biotine et on a ainsi pour chaque streptavidine 4 sites biotine. Les conditions de concentration d’ADN et de streptavidine utilisées sont préalablement définies et permettent d’avoir une biotine pour chaque homo-tétramère de streptavidine.

La stabilité des complexes est étudiée en analysant les complexes au cours du temps (30 min, 24 h et 96 h) après leur préparation. Pour réaliser cette analyse nous avons choisi de compter le nombre de complexes ADN-Ku présent par µm² sur la grille de microscopie au cours du temps.

Etude d’interaction du complexe ADN-Ku-streptavidine avec XLF

- Les complexes ADN-Ku-streptavidine obtenus sont incubés soit avec XLFFL à 10 nM dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 50 mM. Après 15 min d’incubation à 25°C, 5 µl d’échantillon sont déposés sur une grille et sont contrastés soit avec la méthode de coloration positive ou avec la méthode de coloration négative et ensuite sont observés en fond clair ou fond noir respectivement.

La présence de XLF dans les complexes est analysée par marquage aux billes d’or.

- Pour déterminer l’implication du domaine KBM de XLF dans ces interactions, les complexes ADN-Ku-streptavidine obtenus précédemment sont incubés avec XLF224 à 10 nM dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 50 mM. Après 15 min d’incubation à 25°C, 5µl d’échantillon sont déposés sur une grille et contrastés avec la méthode de

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coloration positive et sont ensuite observés en fond noir. Pour chaque condition 600 molécules sont analysées et les complexes bridgés sont quantifiés.

c- Microscopie à force atomique

L’ADN double brin linéaire (500 pb) à 7,5 nM molécules est incubé avec 50 nM de Ku70/Ku80 dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8 NaCl 150 mM pendant 5 min à 25°C. Une goutte de 5 µl de spermidine à 100 µM est déposée sur la feuille de mica fraichement clivée et incubée 1 mn à TA, l’excès de la solution est ensuite adsorbé avec un papier filtre sans cendre. Une goutte de 5µl du complexe ADN-Ku est déposée sur le mica fonctionnalisé, l’échantillon est incubé 1 mn. Quelques gouttes d’acétate d’uranyle à 0,2 % sont déposées sur l’échantillon en inclinant le mica, cela permet d’améliorer l’étalement des molécules. Le mica est séché par adsorption du liquide avec du papier filtre sans cendre. Les échantillons sont conservés dans l’étuve à 37°C avant leurs analyses en AFM. Les images AFM à l’air ont été obtenues en mode contact intermittent sur un AFM Multimode de Veeco Instruments associé au contrôleur Nanoscope IIIa. Nous avons utilisé les microleviers avec une excitation en mode acoustique entre 250 et 350 kHz et une amplitude d’oscillation de quelques nanomètres. Une correction de planéité (flatten) est effectuée sur toutes les images brutes avec le logiciel du Nanoscope. Les images obtenues en AFM sont analysées par image J.