B- Matériels et méthodes
II- 1- Analyses par microscopie électronique à transmission
XRCC4FL, XLFFL seules et le mélange de XRCC4FL, XLFFL à différentes concentrations sont analysés en MET pour déterminer la nature des oligomères formés en solution. Un mutant de XRCC4 dépourvu du domaine C-ter (XRCC4203) est analysé en MET pour déterminer l’impact du domaine tronqué sur la nature des oligomères observés en solution. Les protéines sont analysées en utilisant les deux modes de préparation et d’observation en MET. Des mélanges de XRCC4FL et XLFFL avec différents rapports XRCC4 : XLF sont aussi analysées en MET avec les deux modes de préparation et d’observation.
a- Coloration négative et observation en fond clair
a1- Préparation des grilles
En coloration négative, j’utilise des grilles en cuivre avec un maillage carré (grilles 300 mesh). Les grilles sont d’abord couvertes d’une fine couche de collodion (nitrocellulose, film transparent). Une goutte de collodion est déposée à l’interface eau/air ce qui induit sa polymérisation en un film de plastique transparent, les grilles sont déposées sur le film la face de dépôt d’échantillon sur le film de collodion. On récupère les grilles collodion à l’aide d’un papier filtre sans cendre. Une fois séchées, les grilles sont déposées sur un support dans une cloche sous vide d’un système d’évaporation de carbone de type Balzers MED10. Un morceau de tresse de carbone (~4 cm) est fixé à deux électrodes au dessus des grilles à une distance d’environ 6 cm. Un cache protecteur est placé entre les grilles et la tresse de carbone. Dans un premier temps la tresse est dégazée en la chauffant à haute
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tension et à une pression de 5. 10-4 mbar pendant 45 s, cela permet d’éliminer toutes les impuretés. Lorsque la valeur du vide atteind 7.10-5 mbar, on retire le cache et on chauffe la tresse à nouveau pendant 30s, le carbone s’évapore et se dépose sur les grilles en formant un film de carbone. L’épaisseur du film de carbone dépend de la distance entre la tresse et les grilles, du vide dans la cloche et du temps d’évaporation du carbone. Le film de collodion et la couche de carbone vont servir de support physique à l’échantillon que l’on dépose sur la grille de microscopie.
a2- Effluvage des grilles
Le carbone étant généralement hydrophobe, on réalise un effluvage du film de carbone c’est-à-dire que l’on ionise les éléments de l’air avec un plasma sous vide pour rendre la surface des grilles plus accessible à l’eau et à l’échantillon en suspension. Les grilles collodion-carbone sont placées dans une cloche en verre entre une anode et une cathode sous vide dans l’appareil Balzers MED10. On réalise une entrée d’air constante que l’on équilibre pour avoir un vide proche de 7.10-1 mbar dans la cloche. On applique une tension entre la cathode et l’anode, le potentiel électrique ionise l’air à l’intérieur de la cloche. Les ions formés se déposent sur le carbone, ce qui donne un film de carbone avec une surface globalement hydrophile. Ce procédé est connu sous le nom plasma « glow discharge » (417).
a3- Préparation des échantillons
XRCC4FL ou XLFFL seuls sont dilués dans le tampon A Tris HCl 10 mM pH 8 NaCl 150 mM à une concentration finale de 1 µM, 2 µM ou 4 µM. Un mélange de XRCC4 et XLF avec des rapports (XRCC4 : XLF) de (1 :1), (1 : 0,5) ou (0,5 : 1) sont incubés 10 min à température ambiante (TA) dans le même tampon que les protéines seules.
a4- Coloration négative et observation en fond clair
Un volume de 5µl des échantillons est déposé sur les grilles adaptées à la méthode coloration négative. L’échantillon est incubé 30s à Température Ambiante (TA) pour laisser les protéines s’adsorpber sur le film de carbone. L’excès de solution est éliminé et remplacé avec une goutte d’acétate d’uranyle 2% en inclinant la grille à 45°C. On attend 60 s à TA, puis la grille est séchée à l’aide d’un papier filtre sans cendre type wathman. Cette étape est déterminante puisqu’elle définit la qualité de la coloration (l’épaisseur et
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l’homogénéité de la couche du colorant) et par conséquence la qualité des images obtenues. Les grilles sont conservées dans une boite de grilles.
L’observation se fait à l’aide d’un microscope électronique à transmission Zeiss 912AB Omega avec une tension d’accélération de 120 kV. Cette machine est équipée d’une source d’électrons type LaB6 (cristal d’hexaborure de lanthane), d’un filtre d’énergie et d’une camera CCD (Charge Coupled Devices) Tengra (Olympus) contrôlée par le logiciel iTEM (Olympus).
La grille est insérée dans la colonne du microscope sous vide où elle est soumise à un faisceau d’électron. Une fois que le microscope est réglé pour l’observation en fond clair, plusieurs séries de photos sont collectées.
b- Coloration positive et observation en fond noir
Dans l’analyse des complexes protéiques, cette approche nous permet d’analyser des molécules individuellement. Elle nous permet de faire des études qualitatives et des études quantitatives. Dans les dernières, deux paramètres sont alors quantifiés à savoir la taille et le nombre des filaments XRCC4FL en fonction de la concentration de XRCC4, de la température et du temps ou en présence de l’ADN ou en présence d’XLF.
b1- Préparation du carbone
Un film très fin de carbone (quelques nanomètres) est déposé sur une feuille de mica lisse fraichement clivée. Le protocole d’évaporation de carbone diffère légèrement de celui décrit en coloration négative : on utilise une demi-tresse de carbonne et l’échantillon est placé à au moins 12 cm des électrodes, enfin ce sont les feuilles de mica qui sont utilisées pour déposer le carbone. Ces conditions nous permettent de réaliser des films très fin de carbone (< 5nm) indispensable à l’observation en fond noir. Le carbone sur les feuilles de mica est séché toute la nuit avant d’être utilisé.
b2- Préparation des grilles
En coloration positive on utilise des grilles de cuivre qui possèdent des alvéoles hexagonales (600 mesh) sur lesquelles on dépose le film très fin de carbone (quelques nanomètres). On dépose les grilles sur un papier sans cendre, sur un grillage au fond d’une grande boite de pétri remplie d’eau milliQ (système millipore) dégazée. Le mica recouvert d’un fin film de carbone est plongé dans l’eau avec un angle d’inclinaison d’environ 45°
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par rapport à la surface d’eau. Le film de carbone se sépare du mica et flotte à la surface de l’eau alors que le mica tombe au fond de la boite. A l’aide d’un cadre de téflon, on guide le film de carbone au dessus des grilles. En vidant la boite de pétri doucement, le film de carbone se dépose sur les grilles. Les grilles sont séchées toute la nuit à TA avant leur utilisation.
b3- Ionisation des grilles
L’ionisation par dépôt des groupements NH3+ (charge positive) sur des grilles couvertes de carbone a été initialement développée par J. Dubochet (383). Les grilles sont déposées sur un support entre deux électrodes dans une cloche en verre, reliée à une pompe à vide. Quand le vide atteint la valeur de 15 µmHg (2.10-2 mbar), une goutte d’amylamine est ajoutée, se vaporisant dans l’enceinte sous vide entrainant une dégradation rapide du vide. Le vide est alors controlé et stabilisé à une valeur de 100 µmHg (0,133 mbar). On applique alors une haute tension pendant 40 s, un plasma va ioniser l’amylamine et les groupements NH3+ formés se déposent sur le film de carbone. Au cours de cette étape il faut maintenir un vide entre 100 µm Hg et 130 µm Hg. Après ionisation on casse doucement le vide dans la cloche et on récupère les grilles ionisées. Le dépôt des groupements NH+3 (charges positives) sur le film de carbone permet alors l’adsorption spontanée de l’ADN qui lui est chargé négativement.
b4- Préparation des échantillons
Pour la caractérisation des protéines
Dans certaines expériences nous avons analysé les résultats et décrit les observations, sans faire de quantification ni d’étude statistique. Ces essais ont pour but de caractériser globalement les complexes protéiques. Différentes conditions sont testées.
- XRCC4FL à différentes concentrations (5 nM, 50 nM, 0,25 µM, 0,5 µM et 4 µM) dans un tampon A (Tris HCl 10 mM pH 8, NaCl 150 mM).
- Un mélange de XRCC4 et XLF avec les rapports stœchiométriques (X4FL : XLFFL) suivant (1 :1), (1 : 0,5) et (0,5 : 1) est incubé 10 min à 25°C dans le tampon A
- Pour déterminer l’effet de l’ADN sur l’organisation des filaments XRCC4 seul ou les filaments obtenus pour un mélange XRCC4-XLF. XRCC4 à 200 nM est incubé 30 min à 25°C soit avec l’ADN linéaire 1440 pb à 3 nM molécules soit avec l’ADN superenroulé pUC19 à 3 nM molécules dans le tampon A.. Le mélange de XRCC4 à 200 nM et XLF à
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200 nM est incubé 30 min à 25°C dans le tampon A en présence de l’ADN (1440 pb) à 3 nM molécules.
Pour les études d’assemblage en filament de XRCC4
Afin de comprendre l’assemblage de XRCC4FL en filaments et caractériser les paramètres physico-chimiques qui modulent cet assemblage, ainsi que l’effet de l’ADN et de XLF, différentes conditions sont étudiées.
- Pour étudier l’effet de la concentration, de la température et du temps sur l’assemblage d’XRCC4 en filament : XRCC4FL à une concentration finale de 5 nM, 50 nM, et 250 nM est préparé dans le tampon A. Ces échantillons sont incubés 10 min ou 30 min à différentes températures (4°C, 25°C et 37°C) avant le dépôt avec la méthode de coloration positive et l’observation en fond noir.
- Pour caractériser l’effet de XLF sur l’assemblage de XRCC4 en filament : XRCC4 à 5 nM est incubé 10 min à 25°C dans le tampon A seul ou en présence de XLF avec des rapports stœchiométriques (XRCC4 : XLF) de (1 :1) ou (1 :10).
- Pour déterminer l’effet de l’ADN sur l’assemblage de XRCC4 en filaments : XRCC4 à 5 nM est incubé 10 min à 25°C avec 3 nM molécules d’ADN dans le tampon A. Les fragments d’ADN testés séparément sont des fragments linéaires de 600 pb et 1440 pb.
b5- Coloration positive et observation en fond noir
Une goutte de 5µl de l’échantillon est déposée sur une grille préalablement ionisée et contrastée avec la méthode de coloration positive. L’échantillon est incubé 30s à TA pour permettre l’adsorption sur la surface chargée positivement. L’excès de la solution est enlevé avec 2 gouttes d’acétate d’uranyle à 2% en inclinant la grille. La grille est ensuite sèchée avec un papier filtre sans cendre. Plusieurs grilles sont préparées pour chaque condition.
Les échantillons sont observés en fond noir en utilisant un microscope électronique à transmission modèle Zeiss 912AB (120 kV). Le laboratoire possède un autre microscope électronique à transmission Zeiss 902 (80 kV). Cette machine est équipée d’une source d’électrons (filament de tungstène courbé en forme de V), d’un filtre d’énergie et d’un diaphragme annulaire pour l’observation en fond noir annulaire. Les deux microscopes sont équipés de cameras CCD (Olympus) pilotées par le logiciel iTEM (Olympus).
Pour chaque condition la taille et le nombre de filaments formés sont quantifiés. Les mesures ont été réalisées en analysant 200 carreaux répartis sur 4 grilles, à savoir 50
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carreaux par grille en moyenne. La taille des filaments XRCC4 est mesurée en utilisant l’outil de mesure sur le logiciel iTEM.
c- Marquage aux billes d’or
La présence de XLF dans les filaments obtenus dans un mélange de XRCC4FL et XLFFL est caractérisée par un marquage aux billes d’or. Les billes d’or (5 nm Ni-NTA-Nanogold) consiste en une particule d’or de 5 nm fonctionnalisée avec des groupements Ni-NTA ((nickel (II) nitrilotriacetic acid). Elle est conçue pour la détection ou la localisation de protéines recombinantes avec une étiquette poly-histidine (Tag His) dans des complexes multi-protéiques par microscopie électronique à transmission (MET). Le Tag 6His est constitué de 6 résidus His consécutifs ajouté à la région C-ter de la protéine recombinante dans notre cas XLFFL et XRCC4FL portent un Tag 6His. Une liaison étroite est obtenue lorsque trois groupes Ni-NTA adjacents se lient à une étiquette 6His. La présence du tag 6His sur les deux protéines nous pousse à mettre en place un protocole de marquage non conventionnel. Dans un premier temps nous avons marqué les filaments XRCC4FL seuls pour déterminer l’accessibilité et la spécificté du marquage au tag 6His. Nous mélangeons un volume de 5 µl de X4FL à 14 µM avec 5 µl de billes d’or Ni-NTA à 0,5 µM dans le tampon A. Nous avons choisi de travailler en excès de protéines (28 fois plus que de billes d’or) même si cela suppose que toutes les protéines ne seront pas marquées. Dans un deuxième temps pour l’étude des filaments mixtes, nous avons marqué XLF avec les billes d’or avant de réaliser des filaments avec un mélange de XRCC4 et XLF. XLFFL à 14µM est incubé avec 0,5 µM de billes d’or. Les protéines XLF marquées aux billes d’or sont purifiées sur une colonne Superdex 200. Ainsi l’excès des particules d’or (non fixé à XLF) est éliminé par chromatographie sur gel filtration (voir plus loin le principe). 1 µM de XLFFL marquées est ensuite incubé avec 1 µM de XRCC4FL dans le tampon A pour obtenir des filaments XRCC4-XLF. Pour chaque condition, une goutte de 5 µl d’échantillon est déposée pour réaliser une coloration positive et les observations sont réalisées en fond noir et en fond clair respectivement. Les protéines possèdant le Tag 6His sont marquées avec les billes d'or et peuvent être clairement visualisées par microscopie électronique.