Distribution des récepteurs

Lorsque le cône de croissance adhère fortement au substrat, sa membrane s’étale sur quelques dizaines de microns. Il est en pause, c’est-à-dire dans une phase où son déplacement est très limité et ou son activité consiste à détecter les signaux de guidage avant son déplacement ultérieur. Nous avons observé de tels cônes de croissance, placés dans un gradient artificiel de GABA, avec leurs récepteurs membranaires du GABA_Amarqués par des nanocristaux fluorescents. Des enregistrements en fluorescence des récepteurs ont été réalisés pendant des temps de l’ordre de mille secondes, à raison d’une image par seconde, tandis qu’un gradient était appliqué depuis le début de l’enregistrement à la perpendiculaire de la direction du segment terminal de l’axone.

Les récepteurs sont initialement répartis de façon homogène dans la mem-brane et y diffusent librement. Après une dizaine de minutes, ils commencent à explorer préférentiellement la région la plus proche de la source de GABA et semblent se redistribuer en moyenne vers celle-ci (Figure 3.9).

Fig. 3.9 – Récepteurs dans la membrane d’un cône de croissance initialement (A) et après 17 minutes de stimulation (B). La flèche indique la provenance du GABA et la barre étalon représente 5 µm

Position moyenne des récepteurs

Un indicateur caractérisant cette redistribution peut être l’évolution du barycentre de la position des récepteurs sur chaque image de l’enregistre-ment. Cette procédure a été répétée sur onze cônes de croissance différents. Neuf présentent un déplacement moyen de leurs récepteurs vers la source de GABA, aucun déplacement significatif n’étant remarqué pour les deux autres. La moyenne de ces déplacements est présentée sur la Figure 3.10 ; son amplitude (∼ 3.5 µm soit ∼ 15 − 20% de la taille d’un cône de crois-sance) est significative comme le montre la comparaison à une expérience contrôle sans gradient extérieur (Figure 3.10).

Fig. 3.10 – Position moyenne des récepteurs dans la membrane du cône de croissance soumis à un gradient de GABA (points cyan, n=9) ou sans gradient extérieur (croix vertes, n=10)

La redistribution des récepteurs suit un déroulement temporel particulier et reproductible d’un cône de croissance à un autre. Après une dizaine de minutes où les récepteurs restent sensiblement distribués de façon homogène, ceux-ci se déplacent vers la zone où la concentration de GABA est la plus élevée avec un temps caractéristique de 10.3 min. Il faut noter que ceux-ci ne semblent pas piégés dans une région particulière du cône de croissance mais continuent de diffuser, en explorant préférentiellement le côté proche de la pipette (Figure 3.11).

Lorsque le gradient est coupé après avoir induit l’asymétrie dans la dis-tribution des récepteurs, celle-ci relaxe en quelques minutes vers l’équilibre, les récepteurs étant à nouveau répartis de façon homogène dans la membrane (Figure 3.12).

CHAPITRE 3 L’INTÉGRATION FONCTIONNELLE

Fig. 3.11 – Régions explorées dans la membrane du cône de croissance (A) durant les 500 premières secondes de stimulation (B) et les 500 secondes suivantes (C)

Fig. 3.12 – Déplacement du barycentre de la position des récepteurs sur un cône de croissance. La stimulation asymétrique est activée durant les 34 pre-mières minutes et éteintes durant les 17 suivantes. Le même type de relaxa-tion a été observé sur 3 cône de croissance différents

L’absence de redistribution aux premiers instants de la stimulation par le gradient extérieur révèle un système non linéaire, résultant vraisemblable-ment d’un processus de régulation complexe. Pour rendre compte de cette observation, la courbe de redistribution des récepteurs a été ajustée de façon heuristique par une loi de puissance avec saturation de type Atⁿ/(Tⁿ+ tⁿ) où A et T sont des constantes. Cette loi est inspirée de celles rencontrés pour décrire la concentration de produits de réactions enzymatiques coopé-ratives en fonction de la concentration de substrat. Dans ce cadre, l’exposant n est une mesure du degré de coopérativité dans la réaction - c’est-à-dire du nombre de partenaires impliqués dans la réaction - appelé coefficient de Hill. Ici, n est une estimation de la non-linéarité du processus de redistribution.

Nos données sont ajustées par une loi d’exposant n = 4.9 (Figure 3.10). La valeur élevé de l’exposant témoigne de la non-linéarité du phénomène observé et du renforcement de la redistribution au cours du temps. Ceci suggère l’existence de mécanismes d’amplification de cette réorganisation.

Distribution des récepteurs

Initialement, les récepteurs sont répartis de façon homogène dans la mem-brane du cône de croissance. Ceci s’observe sur la forme de leur distribu-tion cumulative initiale S₀(x) (3.13), qui est approximativement linéaire. L’application d’un gradient de GABA provoque un déplacement significatif (p < 5.10⁻³, test de Kolmogorov-Smirnov) des récepteurs de 15% de la taille totale du cône de croissance vers l’origine du GABA (Figure 3.13).

La forme de la distribution cumulative S_G(x) résultant de l’application du signal de guidage est compatible avec un modèle de déplacement des ré-cepteurs dans un potentiel linéaire U (x) = −λkT x/L, où λ est une constante sans dimension, T la température, k la constante de Boltzmann et L la taille du cône de croissance (Figure 3.13). Dans ce cas la distribution cumulative est donnée par :

S_G(x) = ^{1 − e}

−λx L

1 − e−λ (3.2)

L’ajustement des données expérimentales est satisfaisant (λ = 1.7, Fi-gure 3.13). Ceci permet de supposer que les récepteurs se réorganisent sous l’effet d’interactions reflétant le gradient extérieur linéaire qu’ils détectent. Il serait à ce titre intéressant de réaliser des expériences de redistribution en variant précisément la pente du gradient imposé au cône de croissance, ce qui est impossible avec notre dispositif expérimental. Ceci permettrait d’éva-luer la dépendance de la distribution avec la force du gradient et de vérifier qu’elle est bien donnée à l’équilibre par une répartition de Boltzmann.

CHAPITRE 3 L’INTÉGRATION FONCTIONNELLE

Fig. 3.13 – Distribution cumulative de la position relative de des récepteurs sur 9 cônes de croissance en fonction de la distance normalisée par rapport à la source x_n = x/L où L est la taille du cône de croissance, avant (bleu, n=109) et après (rouge, n=93) application de 1000 s d’un gradient de 10% de GABA. L’ajustement de la distribution expérimentale par une distribution sous un potentiel linéaire est la courbe noire.