DISCUSSION DES RÉSULTATS A 28 JOURS APRÈS IR

Il est maintenant admis que les lésions engendrées par l’IR et l’utilisation chronique de la CsA après la transplantation rénale sont des facteurs non-immunologiques majeurs impliqués dans l’apparition et la progression de la FIAT (Gueler et al. 2004; Cornell et al. 2005).

Dans les trois parties de notre étude à 7, 14 et 28 jours, nous avons utilisé un modèle de rats ayant subis une uninephrectomie suivie 7 jours plus tard d’une IR et d’un traitement quotidien à la CsA pour mimer la situation observée chez les patients transplantés. Les trois périodes de temps progressives nous permettent d’établir une cinétique d’évolution des lésions rénales afin d’étudier l’implication des MAOs dans cette progression.

En comparant nos résultats avec d’autres travaux utilisant un modèle expérimental similaire (Yang et al. 2005; Delbridge et al. 2007), nous observons que le traitement à la CsA suite à l’IR aggrave la fonction rénale avec une augmentation significative de la créatininémie et de l’urémie par rapport au groupe IR seul et accélère l’apparition de la FIAT à 28 jours (groupe IR+CsA vs IR). La néphrotoxicité de la CsA n’est pas liée à une toxicité tubulaire directe mais à un effet vasoconstricteur aggravant les lésions d’IR (English et al. 1987).

Par ailleurs, la fonction rénale s’aggrave aussi avec le temps suite à l’IR+CsA avec une augmentation de la créatinémie et de l’urémie à 7 et 14 jours pour atteindre des valeurs maximales à 28 jours [créatininémie : 85,27 ± 11,93 μM (7 jours), 90,8 ±18,68 μM (14 jours) et 145,9 ± 38 μM (28 jours)]. Le déclin de la fonction rénale en fonction du temps est observé dans la plupart des pathologies rénales chroniques et plus précisément lors de la dysfonction chronique du greffon rénal (Nankivell et al. 2003).

Suite à l’IR rénale, la production excessive des EROs dans la phase aiguë de la reperfusion (peroxyde d'hydrogène, anion superoxyde, radical hydroxyle, etc.) dépasse la capacité anti-oxydante du rein et induit des lésions tissulaires rénales (Droge 2002; Djamali 2007). Ainsi, l’utilisation des anti-oxydants (piégeurs des EROs ou inhibiteurs de leurs synthèses) devrait en théorie constituer une voie thérapeutique limitant les effets délétères de l’IR. Certaines études montrent que les anti-oxydants atténuent les lésions d’IR, d’autres présentent des données controversés. En effet, l’utilisation de la vitamine E (Gottmann et al. 2003), la combinaison d’un inhibiteur de la xanthine oxydase avec un capteur des radicaux hydroxyles (Zager et al. 1994) n'ont aucun effet bénéfique, tandis que l’administration de la SOD ou d’une molécule non

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peptidique mimant la SOD (Salvemini et al. 1999; Kim et al. 2006), l’utilisation de la N- acétylcystéine (Nitescu et al. 2006) ou la pargyline (Kunduzova et al. 2002) protègent le rein en diminuant les lésions établies lors de la reperfusion. Toutefois, ces études sont effectuées dans la phase aiguë de la reperfusion et montrent un effet bénéfique qu’à court terme. Dans la mesure où tous les travaux soulignent le fait que la production excessive des EROs suite à la reperfusion pourrait constituer un événement majeur et déterminant dans l'apparition de la FIAT, nous avons supposé que l’inhibition précoce de la production des EROs aurait un effet bénéfique à plus long terme.

Des travaux dans notre laboratoire ont étudié l’implication des MAOs rénales, sources endogènes des EROs, dans l’apparition des lésions aiguës dans un modèle expérimentale d’IR. En effet, l’administration de la Pg, un inhibiteur irréversible des MAOs, avant IR diminue la mort cellulaire et préserve le parenchyme rénal (jusqu’à 3 jours post IR) (Kunduzova et al. 2002). D’autres études attribuent un rôle anti-apoptotique du L-déprényl, un inhibiteur irréversible de la MAO-B, suite à l’IR rénale (Toronyi 2008). L’ensemble de ces travaux suggère que l’inhibition précoce du stress oxydant lors de l’IR et plus précisément l’inhibition des MAOs, devrait protéger le rein à plus long terme et inhiber l’apparition et la progression de la FIAT.

Dans notre modèle d’IR + CsA, nous avons montré que le traitement des rats avec une dose de Pg protège le rein dès 7 jours avec le maintien d’un effet protecteur jusqu’à 28 jours. En effet, l’administration de la Pg avant ou après IR+CsA améliore la fonction rénale à 7, 14 et 28 jours, diminue la mort cellulaire à 7 et 28 jours et seule la Pg administrée avant IR diminue significativement les lésions histologiques à 28 jours et inhibe l’apparition de la FIAT.

Etant donné que la fibrose résulte d’un déséquilibre entre la dégradation et la synthèse des composants de la MEC, nous avons évalué l’effet de la Pg sur ces deux paramètres à 7, 14 et 28 jours. Nos résultats montrent que l’inhibition de la MAO avant IR est associée non seulement à une diminution de l’expression des collagènes I, III et IV mais aussi à une diminution de l’activité et de l’expression de la MMP-2 suggérant que la Pg entraîne la diminution de la synthèse des composants de la MEC plutôt que l’activation de la voie de dégradation. Ces résultats sont observés dès 7 jours mais ne sont significatifs que lorsque la pathologie est bien développée c’est-à-dire à 28 jours post IR.

En outre, nous observons que l'administration de la Pg avant IR est associée à une diminution de l’expression de la cytokine fibrosante TFG-1 dès 14 jours post IR+CsA. Ce

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résultat corrèle avec des travaux récents montrant in vitro l'interaction entre les EROs et l’expression du TGF-1 lors de la TEM (Rhyu et al. 2005; Bondi et al. 2010). Par ailleurs, une étude in vivo montre que la production des EROs est associée à la surexpression du collagène I et III lors d’une transplantation rénale (Djamali et al. 2005).

Les lésions d’IR associée à la CsA engendrent une réponse inflammatoire intense qui se traduit par l’infiltration des cellules inflammatoires au niveau rénal (Bonventre et al. 2004; Gueler et al. 2004). Dans notre modèle, une inflammation statistiquement significative n’est observée qu’à 28 jours associant une augmentation de l’expression des cytokines pro- inflammatoires IL-1β et TNF-α et une infiltration de cellules mononuclées au sein l’interstitium. L’administration de la Pg avant ou après IR diminue significativement cette inflammation. En effet, des travaux ont montré que certains anti-oxydants induisent un effet anti-inflammatoire (Salvemini et al. 1999; Nitescu et al. 2006) ce qui est en accord avec l’effet anti-inflammatoire de la Pg que nous observons.

L’absence de l’inflammation à 28 jours chez les rats traités à la Pg après IR+CsA n’affecte pas la progression de la FIAT ce qui suggère que dans ce modèle de fibrose, l'inflammation est un événement secondaire par rapport au stress oxydant. Cette dissociation entre inflammation et fibrose est déjà décrit dans le modèle d’obstruction urétérale où une augmentation significative de la fibrose interstitielle est observée chez les souris invalidées pour le récepteur 2 de l'Ang sans modification de l’inflammation (Ma et al. 1998). De même, nous observons une augmentation significative de la fibrose interstitielle chez des souris invalidées pour le récepteur B2 de la bradykinine alors que l’infiltration interstitielle des macrophages diminue (Schanstra et al. 2002). La dissociation entre l’inflammation et la fibrose peut être expliqué par la polarisation des macrophages. En effet, même si l'inflammation rénale totale est réduite, il est possible que les macrophages restants se polarisent vers le sous-type M2 qui peuvent produire des grandes quantités de TGF- favorisant la progression de la fibrose (Lin et al. 2009).

Dans notre modèle d’IR+CsA, la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose augmente à 7 jours, disparaît à 14 jours pour réapparaître à 28 jours après IR+CsA. En parallèle, l’augmentation de la prolifération cellulaire observée à 7 jours chez le groupe IR+CsA, demeure élevée à 14 jours. Cette prolifération pourrait être expliquée par l’activation de la régénération qui se produit au sein du rein agressé. En effet, il a été décrit que dans des modèles d’IR les parties

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nécrosées peuvent être régénérées par plusieurs types de cellules (Witzgall et al. 1994). Il semblerait que ce soit les cellules épithéliales adjacentes aux parties nécrosées qui sont majoritairement impliquées dans ce processus (Lieberthal et al. 2000). Par ailleurs, plusieurs études ont montré l’implication des cellules souches hématopoïétiques qui migrent sur le site lésé, se différencient et prolifèrent (Lin et al. 2003). Toutefois, des résultats controversés montrent que ceux ne sont pas les cellules de la moelle osseuse qui participent en majorité à la régénération chez les souris ischémiés (Duffield et al. 2005).

Par ailleurs, nos résultats montrent que cette régénération cellulaire n’est pas maintenue à 28 jours dans notre modèle d’IR. En effet, l’utilisation chronique de la CsA induit une vasoconstriction qui pourrait induire la raréfaction des vaisseaux caractérisé par une diminution de la densité des artérioles et des capillaires au niveau tissulaire (Prewitt et al. 1982). La diminution des vaisseaux pourrait limiter le recrutement des cellules souches de la moelle osseuse au niveau du rein et inhiber ainsi la prolifération cellulaire à 28 jours IR.

L’absence de l’infiltrat inflammatoire à 7 et 14 jours post IR+CsA est du à l’action immunosuppressive de la CsA. Ces résultats corrèlent avec d’autres études qui montrent l’absence de l’inflammation (marquage spécifique des macrophages et lymphocytes) jusqu’à 10 jours post IR+CsA (Ysebaert et al. 2003). L’apparition de l’inflammation et du stress oxydant à 28 jours dans notre modèle d’IR+CsA résulte de la défaillance du système anti-oxydant rénal à gérer les effets délétères des EROs libérées dans la phase aiguë de la reperfusion.

Conformément aux travaux effectués dans la phase aiguë de la reperfusion (Kunduzova et al. 2002), nos résultats montrent que le traitement préventif à la Pg entraîne un effet anti- apoptotique via la diminution de l’expression de Bax et l’augmentation de l’expression de Bcl2 à 7 et 28 jours et augmente de la prolifération à 14 jours. L’association de ces effets explique l’effet bénéfique de la Pg avant IR sur l’apparition de la FIAT à 28 jours.

Par ailleurs, l’inhibition de la l’activité MAO induite par une dose unique de Pg ne dure que quelques jours (Kunduzova et al. 2002), néanmoins elle est suffisante pour produire un effet anti-oxydant et anti-inflammatoire 28 jours post IR+CsA. En effet, la Pg injectée avant IR entraîne une diminution de l’oxydation de l’ADN (évaluée par 8OHdG) et de la peroxydation lipidique (évaluée par TBARS) ainsi qu’une normalisation de l’expression des gènes anti- oxydants (SOD1 et catalase) et anti-inflammatoires (COX-2 et LOX5). Ces résultats sont

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particulièrement intéressants puisque l’administration de la SOD recombinante seul est sans effet alors que son association avec la catalase recombinante semble être bénéfique (Day 2009).

Il est probable que l’inhibition de la MAO après IR ne permette pas de diminuer suffisamment les EROs produite lors de la phase aiguë de la reperfusion, ce qui explique l’effet non significatif sur la progression de la FIAT obtenu avec le traitement à la Pg après IR à 28 jours. De ce faite, il semble nécessaire de bloquer en préventif la production des EROs afin d’obtenir un effet protecteur significatif à long terme.

En conclusion, dans notre modèle d’IR+CsA, la fonction rénale est améliorée à 28 jours avec l’administration de la Pg avant et après IR, toutefois seule la Pg avant IR inhibe

Conclusion Dans le contexte des atteintes fonctionnelles et tissulaires du greffon qui apparaissent plusieurs années après la transplantation, l’impact initial de l’IR associé à la toxicité des immunosuppresseurs tel que la ciclosporine demeure un problème essentiel. Peu de données ont décrit le rôle des MAOs dans les maladies rénales chroniques. La plupart des études sont surtout focalisées sur le rôle des MAOs rénales dans la clairance des catécholamines ou dans les lésions engendrées dans la phase aiguë de l’IR.

Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence pour la première fois l’implication du stress oxydant induit par les MAOs dans l’apparition de la fibrose rénale. Nous avons montré que le traitement préventif des rats à la Pg, un inhibiteur irréversible des MAOs, préserve la fonction rénale et inhibe l’apparition de la FIAT dans un modèle chronique d’IR aggravé par la CsA (voir schéma récapitulatif).

La première partie de ce travail, effectuée 7 jours après IR+CsA, montre que la Pg inhibe la mort cellulaire indépendamment du temps d’administration de celle-ci (avant ou après IR) et améliore la fonction rénale. La FIAT non développée encore à ce stade, apparaît dès 14 jours après IR et est caractérisée par l’absence de mort cellulaire et d’infiltrat inflammatoire. Le traitement à la Pg avant IR augmente la prolifération à 14 jours et présente une tendance d’inhibition de la FIAT. La dernière partie de ce travail effectuée à 28 jours post IR+CsA, montre que l’inhibition du stress oxydant par la Pg entraîne une diminution de l'infiltration de cellules inflammatoires, une diminution de l'expression des cytokines inflammatoires (IL-1, TNF) et une importante diminution de l'expression de la cytokine fibrosante TGF-. Cela est accompagné par une diminution significative de l'accumulation des composants de la MEC ainsi qu’une diminution de l'apoptose et de la nécrose. L’ensemble de ces mécanismes explique l’absence de la FIAT à 28 jours lorsque la Pg est administrée avant IR. La Pg administrée après IR, semble ralentir la progression de certaines lésions tissulaires en préservant une fonction rénale normale.

L’ensemble de ces résultats permet de progresser dans la connaissance des mécanismes du stress oxydant induit par les MAOs mais également de faire émerger une nouvelle cible thérapeutique potentielle pouvant améliorer la survie du greffon après la transplantation rénale.

Conclusion Schéma récapitulatif

Schéma récapitulatif : Effet de la pargyline sur la FIAT et la fonction rénale

La production d’H2O2 par les MAOs suite à la désamination oxydative des substrats amines tels que la dopamine et la sérotonine entraîne des altérations cellulaires diverses. En effet, le stress oxydant induit par

les MAOs entraîne la mort cellulaire par apoptose (activation de la voie Bax/Bcl2) ou par nécrose tubulaire, la prolifération cellulaire, l’oxydation de l’ADN et la peroxydation lipidique ainsi que l’expression de plusieurs gènes inflammatoires et pro-fibrotiques. L’ensemble de ces lésions stimule la TEM et active les fibroblastes entraînant l’apparition de la FIAT et l’altération de la fonction rénale. Nous

avons pu montrer que la Pg, un inhibiteur de la MAO, inhibe l’apparition de la FIAT et améliore la fonction rénale.

Perspectives

Du point de vue thérapeutique, l'utilisation chronique des inhibiteurs irréversibles des MAOs dans les maladies neurodégénératives a été abandonnée en raison des effets indésirables dus à l'accumulation de la tyramine, phénomène nommé « cheese effect » (Tipton 1994). Toutefois, dans notre étude, on peut raisonnablement penser qu’une seule dose de Pg ne présente pas de tels effets secondaires. De ce fait, on suppose que le traitement à la Pg pourrait avoir un effet bénéfique à long terme si elle est administrée avant la transplantation rénale, dans le liquide de conservation du greffon ou dans les heures qui suivent l’IR.

Par ailleurs, pour la plupart des traitements anti-oxydants effectués dans des modèles expérimentaux, l’efficacité repose sur une intervention très précoce, c’est à dire un jour ou quelques heures avant l’intervention chirurgicale ou juste au moment de l’instauration de la pathologie. Or, chez l’homme, la détection de la fibrose réalisée par le biais des biopsies, n’est faite qu’à un stade avancé de la dysfonction chronique du greffon. Il est donc nécessaire de valider l’effet des traitements ayant un effet bénéfique en préventif, sur la régression de la fibrose. Quelques études, effectuées chez l'animal, vont dans ce sens comme l’administration du Losartan qui est capable de faire régresser la fibrose rénale (Boffa et al. 2003). A partir de ces données, il serait intéressant d’évaluer, dans d’autres modèles chroniques de fibrose rénale, l’effet des inhibiteurs des MAOs sur la régression de la FIAT lorsqu’elle est déjà installée. Par exemple, dans notre modèle d’IR+CsA, il serait judicieux de réinjecter une dose de Pg à 14 jours pour accentuer la voie anti-apoptotique et le système de défense anti-oxydant rénale à ce stade de la fibrose.

Par ailleurs, si l’effet bénéfique de la Pg est en grande partie lié à l’inhibition de la production des EROs, nous pouvons imaginer que l’augmentation de la concentration rénale des catécholamines due à l’inhibition de leurs dégradations joue un rôle protecteur. En effet, certains travaux ont montré que l’incubation des coupes de reins de rat avec la Pg induit une néo-synthèse et une augmentation de la sécrétion de dopamine (Fernandes et al. 1994). De plus, il a été montré que le traitement des rats à la CsA augmente la synthèse de la dopamine au niveau du cortex rénal (Pestana et al. 1995).

La dopamine joue un rôle critique dans la régulation de certaines fonctions rénales. En se fixant sur ses récepteurs de type D1, la dopamine entraîne la dilatation des artérioles afférentes et efférentes (Jose et al. 1998) pouvant diminuer les effets vasoconstricteurs de la CsA. Par ailleurs, des souris invalidées pour le récepteur de la dopamine de type D1 développent une hypertension artérielle suggérant fortement que la dopamine se comporte

Perspectives

fixant sur les récepteurs de type D2 et D3 inhibe la sécrétion de la rénine, enzyme impliquée dans la synthèse de l’Ang I et par la suite la dopamine inhibe la production du puissant vasoconstricteur l’Ang II. De ce fait, il faudrait doser dans notre modèle d’IR+CsA la concentration rénale de dopamine à 7, 14 et 28 jours afin d’évaluer son rôle dans la progression de la FIAT.

L’hypertension artérielle constitue un effet secondaire prédominant lié à l’utilisation chronique de la CsA chez les patients transplantés. Certaines études ont montré que le traitement à la CsA seul pendant 28 jours n’altère pas la pression artérielle systolique lorsque les rats sont soumis à un régime sodé normal (Elzinga et al. 1993). Toutefois d’autres études montrent des résultats controversés sous un régime normal (Yang et al. 2001) ou pauvre en sel (Shihab et al. 1999). Ainsi il serait intéressant de mesurer la pression artérielle chez les rats à 7,14 et 28 jours post IR+CsA afin d’évaluer son impact sur l’aggravation des lésions rénales post IR+CsA.

Le monoxyde d’azote (NO) représente un médiateur important dans la réponse rénale post IR. Des études montrent une surexpression de l’iNOS (NO synthase inductible) au niveau vasculaire et tubulaire rénal dans les 48 heures qui suivent l’IR rénale avec une production massive de NO (Mark et al. 2005). Le NO possède des effets vasodilatateurs mais également il se lie aux EROs pour former du peroxynitrite et se comporte alors comme un anti-oxydant. Ces effets peuvent être considérés comme bénéfiques (Katsuyama et al. 1998; Walker et al. 2000) alors que le peroxynitrite en trop forte concentration est toxique. Cette dualité de l'action locale de NO dans les cellules endothéliales et tubulaires explique les échecs des tentatives d'administration de donneurs de NO (Nakajima et al. 2006) ou au contraire des inhibiteurs non spécifiques de l’iNOS visant à améliorer l'évolution des lésions post-ischémiques (Mark et al. 2005). Ce conflit concernant le rôle du NO au niveau rénal a fait ressortir la nécessité et la relevance de la mesure du NO intrarénal en temps réel (Herrero et al. 2006). Pour cela il existe un capteur ampérométrique récemment mis au point, permettant de mesurer in vivo et en temps réel la production de NO dans le rein (Levine et al. 2001).

Ainsi, nous avons effectué des expériences préliminaires visant à évaluer la production de NO rénal en temps réel dans notre modèle d’IR et étudier l’impact de l’inhibition des MAOs sur cette production. Nous possédons au laboratoire ce type d’éléctrode (WPIP/N- ISONOP007). Les premiers résultats montrent que 15 min après ischémie, le NO augmente

Perspectives

significativement pour atteindre une valeur maximale de 33.5 nM. Cette augmentation est réduite de 50 % après 60 minutes de reperfusion. L’administration de la pargyline 15 minutes avant ischémie semble réduire cette production. Ces résultats restent à confirmer par des expériences supplémentaires comportant des études pharmacologiques et des effets-doses. Ce travail devrait nous permettre d’établir un lien entre le stress oxydant produit par les MAOs et la production de NO dans un modèle d’IR rénale.

REFERENCES

Références bibliographiques

Abbate, M., et al. (2006). "How does proteinuria cause progressive renal damage?" J Am Soc Nephrol 17(11): 2974-84.

Ahmed, A., et al. (2002). "Renal warm ischaemic injury in the rat is potentiated by cyclosporine." Transplant Proc 34(7): 2668-9.

Albrecht, F. E., et al. (1996). "Role of the D1A dopamine receptor in the pathogenesis of