Histoire naturelle de l’hépatite C
3- DIAGNOSTIC SPECIFIQUE
Mise en évidence du virus lui-même et/ou ses constituants (Antigènes, ADN, ARN).
Tableau VI : Marqueurs recherchés dans le diagnostic de l’hépatite virale B et C et leurs méthodes de dosage.
Virus Diagnostic direct Diagnostic indirect
Antigènes Génome viral Anticorps totaux ou IgG IgM HBV - Ag HBs - Ag HBe sérum - ELISA - RIA ADN du VHB - Anti- HBc - Anti- HBs - Anti- HBe Sérum ELISA RIA IgM anti-HBc Sérum ELISA RIA HCV Ag de capside sérum - ELISA ARN du VHC – qualitative • RT-PCR • TMA – quantitative • ADN branchés • PCR compétitive Anti- VHC 1- dépistage: ELISA de 3ème génération 2- validation: RIBA Pas de trousse commercialisée
3-1- Recherche des antigènes et des anticorps viraux et leurs interprétations
3-1-1 HBV
Le diagnostic direct se fait par la recherche des marqueurs d’infection (AgHBs et AgHBe) ou de la réponse immune de l’hôte à une infection virale passée ou en cours d’infection (anticorps anti-HBs, Ig totales et IgM anticorps anti-HBc et anticorps anti-HBe) au niveau sérique à travers l’étude du couple
antigène-anticorps et se fait par la technique ELISA (détection) et RIA (confirmation) [43 ; 52].
Hépatite virale B aiguë [46 ; 53]
Au cours de l'infection aigue, l'antigène HBs est le premier marqueur à apparaître suivi de l’antigène HBe et des anticorps anti-HBc de type IgM et IgG. S'il y a guérison, l'antigène HBe disparaît laissant la place aux anticorps anti-HBe marquant la fin de la réplication virale. Quelques semaines plus tard, la séroconversion HBs se produit avec disparition de l'antigène HBs et apparition des anticorps anti-HBs.
Hépatite virale B chronique [46 ; 53]
Après plus de 6 mois de persistance de l'antigène HBs, l'hépatite passe à la chronicité. Les anticorps anti-HBc sont présents. S'il s'agit d'une forme active, l'antigène HBe est détectable signant la réplication virale. L’apparition des anticorps anti-HBe est un argument en faveur d'une évolution favorable.
Figure 8 : Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’hépatite B aiguë. [46]
Figure 9 : Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’hépatite B chronique.
A-1- Test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) La réaction ELISA est caractérisée par l'utilisation d'un marqueur qui viendra révéler et/ou quantifier la réaction immunologique spécifique constituée par l'union entre l'antigène et l'anticorps [54].
Une lecture qualitative de ce test est réalisable à l’œil nu et la réaction est quantifiable par spectrophotométrie. Elle permet de réaliser des dosages d’antigènes (HBs et HBe) et d’anticorps ((anti-HBs, antiHBc et anti-HBe) à des seuils très bas (1 à 5 ng/ml).
A-2- Technique RIA (Radio-Immuno-Assay)
C’est une méthode très sensible qui se base sur deux techniques : une technique par compétition en phase liquide et une technique direct sur support solide.
Ces méthodes permettent de procéder à une détection mais aussi à un titrage des antigènes et anticorps du virus de l’hépatite B. Elle peut être aussi détectée dans le sérum l’ADN polymérase (l'enzyme de réplication du VHB). Sa présence dans le sérum est également considérée comme le témoin d'une réplication complète du VHB [53].
3-1-2- HCV
B-1- Détection de l’antigène de capside du VHC [6 ; 47]
Un test Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay «Elisa» permettant la détection de l’antigène de capside du VHC dans le sang périphérique a été développé. Son intérêt est la réduction de la fenêtre sérologique de l’infection aigue [47 ; 55].
La détection quantitative de l’antigène de capside du VHC est cependant moins sensible que les tests moléculaires pour la mise en évidence d’une réplication virale, puisqu’il ne détecte pas la réplication en dessous d’une charge virale de l’ordre de 10 000 UI/ml. Un test positif permet de confirmer la présence du virus C. Par contre, un test négatif ne permet pas d’éliminer une hépatite C avec un faible niveau de virémie [6 ; 56]
. B-2- Détection des anticorps anti-HCV
Ces tests permettent la détection d’anticorps spécifiques dirigés contre le VHC. On utilise aujourd’hui des tests de troisième génération, incluant un mélange de protéines recombinantes et de peptides synthétiques viraux, ce qui leur assure une sensibilité, et une spécificité satisfaisantes [57].
B-2-1-Test de dépistage
La détection d’anticorps anti-VHC dans le plasma ou le sérum est fondée sur l’utilisation de tests de type enzymelinked immmosorbent Assay (Elisa). Ceux-ci détectent des anticorps dirigés contre des protéines virales structurales (capside) et non structurales (NS3. NS4 et NS5). Leur sensibilité pourrait être encore améliorée par l’utilisation d’antigènes d’enveloppe.
Au cours de l’hépatite aigue C, les anticorps anti-VHC sont détectables chez 50 à 70 % des malades au début des symptômes. Chez les malades restants, la fenêtre sérologique à une durée variable, de l’ordre de 7 à 8 semaines en moyenne avec les tests actuels [47 ; 50].
De rares faux négatifs peuvent exister (co-infectés VIH-VHC ou patients traités par traitement immunosuppresseur, nouveau nés de mère ARN positive, séroconversions retardées) [40].
B-2-2- Test de validation (Immunoblot)
Le test Chiron RIBA HCV 3.0 SIA® — Strip Immunoblot Assay — Ortho Diagnostic System S.A, Issy-les-Moulineaux, France (RIBA) est un test immunoblot sur bandelettes de nitrocellulose qui permet la détection qualitative des AC dirigés contre les différents antigènes du VHC dans le sérum ou le plasma. Deux antigènes recombinants (c33c et NS5) et deux peptides de synthèse (c100p et 5-1-1p) proviennent d’une région non structurale du virus, le troisième peptide de synthèse (c22p) est codé par la région core [47 ; 58 ; 59].
Un RIBA négatif indique l’absence d’anticorps anti-VHC, par conséquent un test sérologique de dépistage faussement positif. Un RIBA indéterminé ne permettra pas de trancher entre un faux positif et un taux faible d’anticorps (début de séroconversion, traces d’AC chez un patient guéri, porteur chronique immunodéprimé…) ; un second sérum sera nécessaire dans un à deux mois pour la mise en évidence d’une éventuelle séroconversion [59].
Ils semblent garder une utilité dans la qualification des dons de sang, pour différencier les résultats Elisa réellement positifs des fausses réactivités, plus fréquentes dans ces populations à faible risque d’infection. Enfin, les tests de détection des IgM anti-VHC n’ont pas été trouvés [47 ; 59].
Limites des sérologies:
- Uniquement témoin d'un contact avec le virus. - Pas d'information sur la réplication virale.
- Séroconversion tardive au cours de l’hépatite aiguë. Celle-ci peut en effet survenir quelques jours à plusieurs mois après l’épisode aiguë.
-L’existence d’authentiques hépatites chroniques C séronégatives. Celles-ci sont exceptionnelles chez les sujets immunocompétents mais sont fréquentes chez les immunodéprimés et les hémodialysés.
3-2- Recherche du génome viral par des tests moléculaires 3-2-1 HBV
Ce diagnostic repose sur la recherche du génome viral dans le sang ou le foie de patients infectés par le VHB. Cependant, d'autres formes du génome viral peuvent être retrouvées dans le foie et également dans d'autres compartiments comme les cellules mononuclées circulantes. Parmi ces formes on retrouve, dans le noyau des hépatocytes infectes, un ADN épisomal double brins et superenroulé qui sert de matrice à la production de virions infectieux.
[46]
Aujourd'hui, la recherche du génome est réalisée par des techniques quantitatives utilisant une amplification génique (PCR) ou l'hybridation moléculaire avec amplification du signal. [46]
A-1- Polymerase chain reaction (PCR)
La détection de l’ADN viral par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) a représenté un important progrès technique permettant de mettre en évidence la présence de l’acide nucléique viral dans le sérum des sujets infectés par le virus de l’hépatite B (VHB) même lorsque celui-ci est en très faible quantité [37 ; 60].
La PCR appliquée au diagnostic de l’infection par le VHB pose un problème de reproductibilité et de sensibilité et présente des difficultés dans l’interprétation des résultats.
R. Ayari et al. ont analysé les résultats obtenus par la technique PCR en utilisant 13 amorces spécifiques correspondant à différentes régions du génome viral dans le but d’évaluer la spécificité et la sensibilité de la PCR selon le couple d’amorces utilisé. Des résultats satisfaisants sont obtenus avec les amorces qui amplifient les régions pré-S et X [60].
A-2- Technique d’ADN branché
Il s’agit d’une technique d’hybridation moléculaire en phase solide avec amplification du signal par le système d’ADN branchée, afin d’abaisser le seuil de détection du signal. Deux types de sondes d’ADN de trente nucléotides environ s’hybrident sur le génome cible, chacune ayant une double spécificité. Le premier type de sondes (au nombre de 16) s’hybride à la fois sur différentes régions du génome cibles et sur des sondes de capture fixées sur un support solide. Le deuxième type de sondes (au nombre de 14) reconnaît également le génome cible en différents points et s’hybride avec les ADN branché s. Par ce système environ un tiers du génome est reconnu.
Les ADN branchés sont des molécules synthétiques qui possèdent une structure en arbre avec de très nombreuses ramifications. Chacune des ramifications est le site d’hybridation pour plusieurs sondes de révélation couplées à la phosphatase alcaline. L’addition du substrat permet l’enregistrement de chimioluminescence. Cette structure ramifiée créée par la
combinaison des différentes sondes, permet donc une amplification du signal de chimioluminescence. La quantification s’effectue à l’aide d’une gamme d’étalonnage traitée en parallèle [61]
.
Tableau VII : Interprétation des profils sérologiques les plus communs de l’HBV
[40 ; 52]. Ag HBS anti- HBS anti- HBC totaux anti- HBC (IgM) Ag HBe anti- HBe ADN virale Interprétation
- + - (-) (-) (-) (-) Immunité post vaccinale
- +/- + (-) (-) (+) (-) Contact ancien, Guérison
+ (-) (-) + (+) (-) (+++) Hépatite aiguë
+ - + (-) - + - a Porteur non répliquant
+ - + (-) + - +++ Hépatite chronique (virus sauvage)
+ - + (-) - + ++ b Hépatite chronique (virus mutant)
( ) : les examens inutiles à demander pour l’interprétation.
a
: Un taux inférieur à 10 000 copies par millilitre est non significatif et compatible avec le diagnostic de porteur non répliquant. Il n’y a pas de maladie hépatique évolutive.
b
: Le taux sérique de particules virales peut être faible en cas d’infection par le virus mutant. Ce taux est le plus souvent supérieur à 100 000 copies.
3-2-2 HCV
La détection d'anticorps anti-VHC permet d'identifier une infection par le VHC. Cependant, il est essentiel de rechercher le génome viral, à savoir l'ARN VHC, dans le sérum des patients, pour faire la différence entre infection ancienne guérie et infection chronique avec multiplication virale [62]. A- Méthodes qualitatives de détection de l’ARN du VHC
A-1- La RT- PCR
La RT-PCR, amplification en chaîne par polymérase après reverse transcription, a été la première technique mise au point pour détecter l'ARN VHC. Cette technique est basée sur le principe de l'amplification sélective
d'une séquence d'ADN double brin complémentaire, obtenue après reverse transcription de l'ARN VHC. La première étape de la RT-PCR, appelée étape d'extraction/précipitation, permet de récupérer, après lyse des particules virales, l'ARN VHC débarrassé de toute substance potentiellement interférente. La deuxième étape est l’étape de transcription inverse, alors que la troisième, dite «étape d'amplification», permet l'obtention d'un grand nombre d'ADN double brins complémentaires de l'ARN VHC-cible.
La dernière étape consiste à détecter le produit d'amplification, selon divers procédés d'analyse. La RT-PCR est largement utilisée dans la pratique courante des laboratoires de diagnostic d'hépatite C [62]. Sa sensibilité est actuellement très bonne avec un seuil de détection de 10UI/ml [40 ; 63].
A-2- Transcription Mediated Amplification(TMA)
Cette technique utilise comme principe d’amplification la synthèse d’ARN à une température constante (isotherme) de 41,5 °C [37]
.
La première étape de la TMA n'est pas une étape d'extraction/précipitation mais une étape dite «d'extraction/capture». L’ARN VHC, libéré, après lyse des particules virales, est récupèré par hybridation moléculaire sur des particules magnétiques. La deuxième étape d'amplification permet l'obtention d'un grand nombre de copies de transcrits d'ARN, après création d'un modèle d'ADN double brin. Le produit d'amplification de la TMA se compose donc essentiellement d'ARN, alors que celui de la RT-PCR se compose d'ADN complémentaire. La troisième étape de la TMA consiste à détecter le produit d'amplification en se basant sur un
principe d'hybridation protégée. La chimioluminescence n'est détectée qu'en présence d'hybrides formés avec les transcrits d'ARN [62].
B- Méthodes de quantification de l’ARN viral
Elle a pour intérêt essentiel le suivi d’un traitement antiviral. La quantification n’a aucun intérêt diagnostique ou pronostique et ne doit pas être demandée en l’absence d’une décision thérapeutique qui sera prise sur d’autres critères. Son seuil de sensibilité est de 600 UI/ml [40]
.
B-1- Technique d’ADN branché
La seule méthode de quantification virale largement évaluée à ce jour est la technique des ADN branchés (Quantiplex HCV RNA, Chiron Diagnostics), qui permet de déterminer la quantité d’ARN présente dans un prélèvement en comparant le résultat obtenu sur une courbe standard établie, à chaque manipulation, à partir d’acides nucléiques viraux synthétiques présents en quantités connues. Cette méthode a fait la preuve de sa bonne reproductibilité et de sa standardisation.
B-2- PCR compétitive
Des techniques alternatives de quantification, fondées sur l’amplification de la cible en compétition avec un acide nucléique présent en quantité connue, sont en cours d’évaluation. II s’agit de la PCR quantitative (Amplicor HCV Monitor, Roche Diagnostic Systems) et du NASBA HCV quantitatif (Organon Teknika).
Tableau VIII : Interprétation des profils sérologique de l’HCV [40].
Anticorps anti-VHC ARN viral (PCR) Interprétation
Négatif Inutile a Absence de contact
Absence d’infection virale
Positif Négatif Contact ancien
Guérison virologique
Positif Positif Infection virale évolutive
a
: Sauf cas exceptionnel. Chez l’immunodéprimé, la sérologie peut être négative et l’ARN positif témoin alors d’une maladie virale évolutive.
3-3- Diagnostic histologique [41 ; 49 ; 64].
La biopsie de foie est un examen important. Cet examen est à proposer aux malades chez lesquels on envisage un traitement, c'est-à-dire ceux ayant une élévation des transaminases, un ADN du VHB et un ARN du VHC positif. La biopsie de foie est effectuée actuellement sous échographie.
Les buts de la biopsie hépatique chez un malade infecté par le virus de l’hépatite B et C sont, d’une part, d’estimer le risque de progression de la maladie et, d’autre part, d’estimer le bénéfice potentiel du traitement antiviral.
La ponction biopsie hépatique permet :
D’affirmer le diagnostic d’hépatite chronique ;
De faire le bilan lésionnel évaluant l’intensité des lésions ;
De préciser l’éventuelle aggravation ou amélioration des lésions par rapport aux biopsies hépatiques antérieures, qu’il y ait eu ou non un traitement ;