3. Techniques moléculaires
3.3. Développement et amplification des marqueurs microsatellites
3.3.1. Mise au point des banques microsatellites et validation des couples d'amorce
Une banque microsatellite spécifique à chaque espèce a été développée dans le cadre de cette thèse. Pour la mise en place de ces deux banques, l'ADN génomique a été extrait à partir de 20 ouvriers issus d’une colonie d'E. neotenicus et de 40 soldats issus de deux colonies de S.
minutus. Les ADN ont ensuite été envoyés à la société Genoscreen (Lille, France) pour la
mise au point des banques microsatellites, réalisée par un séquençage haut débit via la plateforme de pyroséquençage 454 GS-FLX® (Roche Diagnostics) après fragmentation, enrichissement en séquences microsatellites et amplification par PCR de l’ADN enrichi (Malausa et al., 2011). Au total, 219 couples d'amorces ont été validés in silico à partir de 12493 séquences présentant des motifs microsatellites pour E. neotenicus et 94 couples d'amorces encadrant des motifs microsatellites ont été validés à partir de 4933 séquences pour
S. minutus. 23 et 30 couples pour E. neotenicus et S. minutus, respectivement, ont ensuite été
testés biologiquement à partir de 8 et 10 ADN d’individus provenant de colonies différentes. Les réactions PCRs monoplexes (amplification d’un seul fragment à partir d’un couple d’amorces) pour tester ces couples d'amorces ont été réalisées dans un volume final de 12,5 μL, avec 1X de tampon de réaction, 1,5 mM de MgCl2, 0,24 mM de dNTPs, 0,4 μM de chaque amorce non marquée, 0,04 U/μL de FastStartTaq DNA Polymerase (Roche, France), 1 à 2 μL d'ADN dilué au demi et d’eau ultra-pure q.s.p. 12,5 μL. Le programme PCR suivant a été utilisé : une dénaturation initiale à 95°C pendant 10 min, suivie par 40 cycles à 95°C
61 pendant 30 sec, 55°C durant 30 sec et 72°C pendant 1 min puis une élongation finale à 72°C pendant 10 min.
Pour qu'un marqueur microsatellite soit validé biologiquement, nous avons pris en compte les paramètres suivants :
Une amplification du produit PCR de la taille attendue,
une absence de bandes aspécifiques (i.e. une seule bande de la taille attendue) sur gel d’agarose,
un potentiel « polymorphe » des marqueurs (i.e. des bandes de tailles différentes entre les différents individus) sur gel d’agarose.
Ainsi, neuf et dix couples ont été validés biologiquement pour E. neotenicus et S.
minutus, respectivement. Pour E. neotenicus, cinq couples ont été validés dans un premier
temps pour l'étude du système de reproduction, puis vingt autres couples ont été testés dont quatre ont été validés biologiquement pour l'étude de génétique des populations.
3.3.2. Amplification des marqueurs microsatellites 3.3.2.1. Polymorphisme des loci microsatellites
Les couples d’amorces validés biologiquement ont été utilisés pour caractériser le polymorphisme des marqueurs microsatellites par génotypage sur séquenceur automatique (Malausa et al., 2011). Le polymorphisme des marqueurs a été testé sur un individu (ouvrier ou soldat) provenant de 43 colonies pour E. neotenicus et de 74 colonies pour S. minutus.
Pour réaliser l’analyse de ces fragments microsatellites, une seule des amorces de chaque couple a été marquée à la fluorescence, avec des fluorophores différents pour les loci dont la longueur de fragment était proche et risquant de se chevaucher à la lecture des profils. Les mêmes fluorophores ont parfois été utilisés pour les loci de tailles éloignées. Le protocole et les conditions PCR ont été les mêmes que ceux cités précédemment pour la validation biologique des marqueurs. Pour l’analyse de fragments, les produits PCR ont préalablement été dilués au 10ième, au 20ième ou au 50ième selon le nombre de marqueurs, puis 1 μL de chaque produit PCR a été ajouté à un mélange de 0,5 μL de marqueur de taille standard Liz500 et 16,5 μL de formamide pour chaque individu. Les mélanges ont été déposés à la plateforme
62 génomique de l’IMRB de l’hôpital Henri Mondor (Créteil, France). Les profils obtenus ont été analysés avec le logiciel GeneMarker v. 2.6.3 software (Applied Biosystems) puis avec le logiciel GeneMapper® v. 5 (Applied Biosystems).
3.3.2.2. Amplification par PCR multiplexe
Une fois les loci polymorphes identifiés, nous avons associé certains d’entre eux en fonction de leur taille et de leur fluorophore afin de pouvoir réaliser des multiplexes c’est-à-dire des co-amplifications avec plusieurs couples d’amorces dans la même réaction PCR. Un mélange d’amorces a été préparé pour chaque multiplexe avec une concentration finale pour chaque amorce de 2 μM. Au total, deux et trois multiplexes ont été mis en place pour E.
neotenicus et S. minutus, respectivement (Tableau 3). Le protocole PCR a été le suivant : 1 X
Qiagen Multiplex PCR Master Mix, 0,2 μM du mélange d’amorces, 1 à 2 μL d’ADN et de l’eau ultra-pure q.s.p. 12,5μL. Le programme PCR suivant a été utilisé : une dénaturation initiale à 95°C pendant 10 min, suivie par 35 cycles à 95°C pendant 30 sec, 55°C durant 90 sec et 72°C pendant 30 sec puis une élongation finale à 68°C pendant 10 min.
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Tableau 3 : Organisation en multiplexes des marqueurs microsatellites développés pour E. neotenicus et S. minutus. En : Embiratermes neotenicus, Sm :
Silvestritermes minutus, Lal : Labiotermes labralis.
Espèce Locus Motif Séquence des amorces (5’- 3’) Fluorophore Référence
Embiratermes neotenicus Multiplexe 1
Fougeyrollas et al. (2015)
En-05 (tgg)12 5’-ACGCAGCAGTAGGTACAGGAA-3’ PET
5’-TCCAACCACAACCACTAGCA-3’
En-11 (ac)14 5’-CCAACTCGTAGGTGTAGAGGAT-3’ NED
5’-CCGTCTCTTGTGAGTGTTGTG-3’
Multiplexe 2
En-08 (ac)13 5’-CTGAGCGGTTGCAGAGTACC-3’ 6'FAM
5’-TTCCCGGCCAAAGTACTAAC-3’
En-10 (tg)14 5’-CGTCCAGAAGATTCCTACCG-3’ NED
5’-TCTCTACCTCGTGTCTGCCT-3’
En-15 (ca)15 5’-CGATGAGATTCCGTAGACACC-3’ NED
5’-AACCCTAGCACCTCACATGC-3’
En-19 (tg)17 5’-TACATTCAAATTAGTCTTGTGCCC-3’ PET
5’-TTGGTCGAGCCTATCTGGTC-3’
En-21 (tac)18 5’-ACCATAACAACTACTACCACTACCACT-3’ VIC
5’-TCGTAACTAAGTGTTGAATGTGAATTT-3’
Multiplexe 1
Fougeyrollas et al. (2015)
En-08 (ac)13 5’-CTGAGCGGTTGCAGAGTACC-3’ 6'FAM
5’-TTCCCGGCCAAAGTACTAAC-3’
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5’-TCTCTACCTCGTGTCTGCCT-3’
En-11 (ac)14 5’-CCAACTCGTAGGTGTAGAGGAT-3’ NED
5’-CCGTCTCTTGTGAGTGTTGTG-3’
En-15 (ca)15 5’-CGATGAGATTCCGTAGACACC-3’ NED
5’-AACCCTAGCACCTCACATGC-3’
En-19 (tg)17 5’-TACATTCAAATTAGTCTTGTGCCC-3’ PET
5’-TTGGTCGAGCCTATCTGGTC-3’
Multiplexe 2
Fougeyrollas et al. (en
préparation)
En-25 (ac)11 5’-AGTTCGCGTTCAGAAGAAGC-3’ NED
5’-TTCTCAATCAATGCAACCTGTC-3’
En-35 (ca)09 5’-ACAGAGTGGCCTCTTTACGC-3’ 6'FAM
5’-CCCATTCAAGCACGTCTGTA-3’
En-37 (ac)09 5’-ACGCGCACAGTATTGCAT-3’ 6'FAM
5’-TGAGTGTGGTGGGGTAATGT-3’
En-39 (ag)09 5’-GCTTCCAGTGTAAATCACAATTTC-3’ PET
5’-GCAGTGAGATTTGTAGCCCC-3’
Silvestritermes minutus Multiplexe 1
Sm-02 (tg)08 5’-GGGTTGTGAAGTTGACCGTT-3’ NED
Fougeyrollas et al. (soumis) 5’-GGGTCGACGATGATACAGGA-3’
Sm-22 (ag)15 5’-CTTGCGACGAAACGTCAGT-3’ 6'FAM
5’-TCACAACCAGTAATTGGAATGC-3’
En-35 (ca)09 5’-ACAGAGTGGCCTCTTTACGC-3’ NED
Fougeyrollas et al. (en
préparation) 5’-CCCATTCAAGCACGTCTGTA-3’
En-39 (ag)09 5’-GCTTCCAGTGTAAATCACAATTTC-3’ PET
65 Multiplexe 2
Sm-05 (ac)08 5’-ACGCAGGGTCTTAGTGAAGC-3’ VIC
Fougeyrollas et al. (soumis) 5’-TTTATATCTTACATGATAATCACGGG-3’
Sm-06 (gt)09 5’-AACCCACCTACAACTGTGCC-3’ PET
5’-GCATGTGTTGGTGCACATAAAT-3’
Sm-16 (ca)11 5’-GGAAAGGGATAACAATAAAATCAGG-3’ 6'FAM
5’-TGCACGAACAACCTCAATGT-3’
Sm-23 (ac)16 5’-ACATGGCTTGAATCTGCTGC-3’ 6'FAM
5’-TCCACAACCTGATGATGGC-3’
Sm-25 (ca)17 5’-AAACAAACATGGCGTCCAAT-3’ VIC
5’-TCAACTGATGTGGTGACAGTCT-3’
Sm-27 (ca)20 5’-AGCAAACTGACATGTGTCGC-3’ PET
5’-GAACGTAGTTGTCTTGGCAGG-3’
Multiplexe 3
Lal-5 (ca)18 5’-TTTGTGGT CTGGTGCTTAT-3’ PET Dupont et al.
(2009) 5’-ATGCTGACTTTGGCAGAACG-3’
En-15 (ca)15 5’-CGATGAGATTCCGTAGACACC-3’ NED Fougeyrollas et
al. (2015) 5’-AACCCTAGCACCTCACATGC-3’
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