Détermination des masses moléculaires des produits en solution

Différentes techniques analytiques peuvent être utilisées pour estimer les masses moléculaires des composés. Dans cette optique, l'approche analytique développée au cours de ce travail de thèse fait appel à des méthodes de FT-ICR/MS et de SEC.

III.2.a Caractérisation des produits en solution par ESI⁺-FT-ICR/MS

Phase aqueuse

Ex Bois ^{Phase organique} Ex Bois

Phase aqueuse Ex Cellulose Phase aqueuse Ex Lignine Phase organique Ex Cellulose Phase organique Ex Lignine

Figure D-44 : Spectres de masse ESI+-FT-ICR/MS des phases aqueuses de conversion de a) bois, c) cellulose, e) lignine, g) glucose, i) aq vanilline et des phases organiques de conversion b) bois, d) cellulose,

f) lignine, h) glucose

Il a été montré dans l'Annexe n°II que les ratios m/z mesurés pour les ions provenant des produits de conversion hydrothermale des lignocelluloses peuvent être considérés comme correspondant aux masses moléculaires de ces ions du fait qu'ils soient monochargés.

L'ionisation ne se faisant pas avec la même efficacité pour tous les composés chimiques, les coefficients de réponse des composés sont très différents, et ce même pour des composés appartenant à une même famille chimique et de structures chimiques proches (Annexe n°II). Ainsi, l'intensité relative d'un pic par rapport à un autre ne traduit pas nécessairement l'abondance relative d'un composé par rapport à un l'autre dans l'échantillon analysé. Par conséquent, des composés à l'état de traces facilement ionisables peuvent être observés sur le spectre de masse avec les ions provenant des composés significativement présents dans un échantillon. Il est donc important de rappeler que la méthode de spectrométrie de masse FT-ICR/MS développée dans cette thèse n'est pas une méthode quantitative. Phase organique Ex Glucose Phase aqueuse Ex Glucose Phase aqueuse Ex Vanilline

gamme de ratios m/z, les différents composés contenus dans les échantillons sont donc très nombreux et présentent une très grande polydiversité en masses moléculaires excepté dans le cas de la vanilline.

Des zones présentant des pics de faibles intensités et isolés se trouvent dans la gamme la plus élevée des valeurs m/z. Ces zones correspondent aux m/z où le rapport signal sur bruit du spectromètre de masse est faible. Cette caractéristique des spectres de masse FT-ICR/MS provient de la grande sensibilité du spectromètre de masse (Marshall et al., 1998). Dans ces zones, les ions qui proviennent de l'échantillon ne peuvent pas être distingués du bruit de l'appareil. Par conséquent, la valeur maximale m/z des produits de conversion ne peut pas être déterminée avec précision mais peut être néanmoins estimée (Tableau D-12). Les observations expérimentales ont permis de déterminer que l'estimation de la valeur maximale m/z des spectres de masses pouvait être estimée à environs 200 Th près.

Tableau D-12 : Estimation du ratio m/z maximal détecté par ESI(+)-FT-ICR/MS pour les produits de conversion (phases aqueuses et organiques)

Type d'échantillon Charge lignocellulosique m/z maximal estimé (Th)

Bois 650-850 Cellulose 550-750 Lignine 650-850 Glucose 550-750 Phase aqueuse Vanilline 500-700 Bois 800-1000 Cellulose 800-1000 Lignine 800-1000 Phase organique Glucose 800-1000

Des similitudes entre échantillons peuvent être observées : les phases aqueuses issues de la conversion de bois et de la lignine ont des distributions avec des ratios m/z allant jusqu'à environ 650-850 u alors que ceux des effluents de la cellulose et le glucose sont détectés jusqu'à environ 550-750 u. Quant au spectre de masse de la vanilline, l'absence de distribution gaussienne rend la détermination du m/z maximal encore plus délicate mais les ions semblent être détectés jusqu'à environ 300-700 u. Dans le cas des phases organiques, des ions sont détectés avec des masses plus importantes que dans le cas des phases aqueuses, toutes les distributions allant jusqu'à environ 800-1000 u.

En conclusion, la spectrométrie de masse ESI⁺-FT-ICR est une technique analytique

adaptée pour la caractérisation des produits de conversion de biomasse formant un mélange très polydisperse mais qui sont solubles dans l'eau ou le méthanol. Cette méthode de très haute résolution apporte des informations sur les masses moléculaires de l'ensemble des produits et un ordre de grandeur de leur gamme de masses moléculaires. Cependant, les limites de la méthode pour nos produits sont d'une part de ne pas déterminer précisément la valeur maximale de la gamme de masses moléculaires et d'autre part de ne pas permettre la quantification des différents composés. Ainsi, pour apporter des informations sur la distribution en masses moléculaires des produits de conversion, une démarche d'analyses croisées a été réalisée en utilisant la chromatographie d'exclusion stérique comme outil analytique complémentaire.

III.2.b Caractérisation des produits en solution par SEC-UV

Pour apporter des informations complémentaires aux caractérisations des masses moléculaires mesurées par FT-ICR/MS, une méthode de chromatographie d'exclusion stérique (SEC) a été mise en œuvre. L'avantage de cette technique réside dans ses capacités à apporter une information semi-quantitative sur les produits séparés en fonction de leur volume hydrodynamique (Partie VI.3.c. du chapitre C et Annexe n°II).

L'estimation des masses moléculaires des composés à partir de leur temps de rétention nécessite une étape d'étalonnage. De manière à minimiser l'erreur d'estimation, les étalons ont été choisis comme ayant des propriétés similaires aux composés de hautes masses moléculaires identifiés par GC dans les échantillons de conversion. L'étalonnage a été réalisé à l'aide de la vanilline, le 2,2'-biphénol et la monobenzone dont les masses moléculaires sont de 152, 186 et 200 g/mol respectivement. La Figure D-45 présente le chromatogramme SEC des étalons ainsi que celui de la phase aqueuse de conversion du glucose en mode batch à 370°C, 25 MPa pour un temps de conversion de 30 minutes.

A U 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 2,20 2,40 2,60 2,80 3,00 3,20 3,40 Minutes 26,00 27,00 28,00 29,00 30,00 31,00 32,00 33,00 34,00 35,00 36,00 37,00 38,00 39,00 40,00

Figure D-45 : Chromatogrammes d'exclusion stérique des étalons de vanilline, 2,2'-biphénol et monobenzone et de la phase aqueuse de conversion du glucose (batch, 370°C, 25 MPa, 30 minutes)

Les temps de rétention des étalons sont d'environ 31,0, 31,5 et 32,4 minutes respectivement pour la monobenzone, le 2,2'-biphénol et la vanilline. Des artéfacts liés à la forte concentration des étalons sont visibles sous forme d'un petit pic à un temps de rétention de 30,2 minutes. Cependant, des produits aqueux de conversion du glucose sont détectés dès 28 minutes soit avant le pic de la monobenzone, ce qui montre que des produits de masses moléculaires plus importantes que 200 g/mol seraient présents dans l'échantillon. Cette

observation est cohérente avec les masses importantes détectées par ESI⁺-FT-ICR/MS.

Phase aqueuse de la conversion du glucose (Essai IV)

Monobenzone (200 g/mol) 2,2'-Biphénol (186 g/mol)

A U 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 Minutes 24,00 25,00 26,00 27,00 28,00 29,00 30,00 31,00 32,00 33,00 34,00 35,00 36,00 37,00 38,00 39,00 40,00 41,00 42,00

Figure D-46 : Chromatogrammes d'exclusion stérique de la phase aqueuse et de la phase organique de conversion hydrothermale du bois (batch, 370°C, 25 MPa, 30 minutes)

Le chromatogramme confirme que les produits hydroinsolubles comportent des composés de masses moléculaires bien plus importantes que les produits aqueux comme le montrait précédemment les spectres de masses FT-ICR/MS. La zone de recouvrement des chromatogrammes semble montrer que certains composés de masses moléculaires moyennes sont communs aux deux phases. Cette particularité pourrait provenir du fait que les effluents aient subi une séparation de phase après conversion : les composés de faibles masses moléculaires sont solubilisés dans l'eau tandis que les composés de hautes masses moléculaires sont totalement insolubles dans l'eau et forment les produits hydroinsolubles ; les composés de masses moléculaires intermédiaires se partageant entre les deux phases.

Cependant la méthode d'étalonnage employée ne permet pas de déterminer à partir des chromatogrammes les masses moléculaires précises des produits de hautes masses moléculaires dont les structures chimiques n'ont pas été identifiées. Toutefois une estimation peut être donnée à l'aide d'étalons polystyrène. Les composés de plus hautes masses moléculaires de la phase organique provenant du glucose auraient des masses de l'ordre de 1000 g/mol en équivalent polystyrène, ce qui est cohérent avec les données obtenues par FT-ICR/MS.

III.2.c Conclusion sur la détermination des masses moléculaires

Les mélanges étudiés étant très complexes chimiquement et très polydisperses en terme de masses moléculaires, deux méthodes analytiques complémentaires ont été utilisées :

i) la spectrométrie de masse FT-ICR de très haute résolution qui permet de mesurer les masses

moléculaires des composés avec toutefois une dépendance des facteurs de réponse des

composés par rapport à leur nature chimique ; ii) la chromatographie d'exclusion stérique

Produits hydroinsolubles du bois solubles dans le

méthanol (essai I)

Produits aqueux du bois (essai I)

couplée à un détecteur UV qui permet une analyse semi-quantitative et donc une comparaison relative entre les distributions de différents échantillons.

Une bonne concordance peut être observée pour les gammes de masses moléculaires obtenues par les deux techniques. Elles montrent que d'une part des produits aqueux ont des masses moléculaires supérieures à 200 g/mol même pour la conversion du glucose qui a une masse moléculaire de 180 g/mol ; et que d'autre part la gamme de masses moléculaires de produits des phases organiques s'étend jusqu'à environ 1000 g/mol, ce qui est bien plus important que celle des produits aqueux.

La complémentarité de ces deux techniques réside dans le fait que d'une part,

contrairement à la SEC, l'analyse ESI⁺-FT-ICR/MS permet de mesurer précisément la masse

moléculaire des composés et d'autre part que contrairement au FT-ICR/MS, l'analyse SEC permet de montrer par son caractère semi-quantitatif que les produits de faibles masses moléculaires sont majoritairement présents dans les phases aqueuses alors que les produits de hautes masses moléculaires sont majoritairement présent dans les phases organiques.