Cytométrie en flux

4.5.1 Marquage extracellulaire

Le marquage extracellulaire des cellules a permis de suivre le phénotype des cellules tout au long des cultures. Tous les anticorps utilisés étaient des monoclonaux de souris couplés à des molécules fluorescentes

et étaient utilisés à une concentration de 1g/106 _{cellules. À moins d’indications contraires, toutes les}

incubations ont été effectuées à la noirceur et à température pièce. Les anticorps ciblant le CD3 couplé à l’APC et le CD38 couplé au PCP-Cy5.5 provenaient tous deux de chez BD (BD Biosciences). Les anticorps ciblant le CD19 couplé au PE-Cy7, CD70 et CD126 couplé au PE provenaient de Pharmingen (BD Biosciences). Les anticorps ciblant le CD27 couplé à l’APCefluor, CD31 couplé au FITC, CD38 et CD267 (anti- TACI) couplés au PE, CD39 couplé au PCP-efluor 710 et CD184 (CXCR4) couplé au PE-Cy7 provenaient de eBioscience. L’anti-CD45 couplé au Krome Orange provenait de chez Immunotech (Vaudreuil-Dorion, Qc, Canada) alors que l’anti-CD138 couplé au Alexa efluor 647 provenait de chez AbD Serotec (Raleigh, NC, É.- U.). L’anti-CD269 (anti-BCMA) couplé au PE quant à lui provenait de VWR (Mississauga, ON, Canada). Pour chaque test, environ 1x106 _{cellules ont été lavées avec du PBS-glucose et centrifugées à 1000 g}

pendant 6 min et mises en suspension dans 100 L d’une solution de PBS-1% (v/v) contenant FBS-0.01% (v/v) NaN3. Les cellules ont ensuite été incubées avec 10ng/mL de Pacific Blue (Molecular Probes, Life

Technologies) pendant 30 min dans l’obscurité après quoi elles ont été lavées avec la solution de PBS-FBS- NaN3 et mises en suspension dans cette même solution à raison de 100 l de cellules par test. Elles ont par la

suite été mélangées aux anticorps et incubées pendant 15 à 30 min. La fixation a été faite avec une solution de formaldéhyde 2 % (Sigma Aldrich) et suivie d’une étape de lavage après quoi les cellules ont été mises en suspension dans 1,2 mL de PBS-FBS-NaN3 et conservées à 4 °C jusqu’à l’acquisition des données avec le

cytomètre, soit 18 à 20h suivant le marquage.

Dans le cas des marquages des cellules de moelle osseuse, les cellules ont été mises en suspension dans une solution de PBS-FBS-NaN3 contenant 0.001 mM de Sytox Blue (Molecular Probes, Life Technologies),

afin d’exclure les cellules mortes. Ces cellules n’ont pas été fixées et l’acquisition au cytomètre a été faite immédiatement après le marquage.

Des billes de compensation Compbeads (BD Biosciences) ont été préparées avec des témoins isotypiques de souris (IgG1) pour les fluorochromes non couplés en tandem (FITC, PE, APC) ou aux anticorps anti-CD19,

anti-CD39, anti-CD138, anti-CD27 ou anti-CD45, afin d’effectuer la compensation entre les différents fluorochromes utilisés. Des contrôles de fluorescence minus one (FMO) ont été faits afin de déterminer l’emplacement des quadrants séparant les cellules positives des négatives d’un marqueur donné. L’acquisition des évènements a été effectuée à l’aide d’un cytomètre en flux Partec CyFlow (Partec, Swedesboro, NJ, É.- U.) et le logiciel Flomax 3.0, en ciblant de 10 000 à 300 000 évènements. Les données ont été subséquemment analysées à l’aide du logiciel FCS Express 4.0 (De Novo Software, Los Angeles, CA, É.-U.)

4.5.2 Comparaison des clones d’anticorps anti-CD138

Étant donné l’importance du CD138 dans la reconnaissance des plasmocytes autant in vitro qu’in vivo, une étude comparative de différents clones anti-CD138 a été faite. Ces essais ont été menés sur des lymphocytes B humains cultivés in vitro, des PBMC ainsi que des cellules mononuclées de la moelle osseuse. Les cellules ont donc été marquées selon le protocole décrit à la section 4.5.1 avec les cinq anticorps monoclonaux anti- CD138 couplé au PE, soit B-A38 (AbCam, Cambridge, MA, É.-U.), B-B4 PE (AbD Serotec) DL101 (Biolegend, San Diego, CA É.-U. et eBioscience) et MI-15 (BD Biosciences) et aussi B-A38 couplé avec l’Alexa 647(AbD Serotec). Le marqueur de viabilité utilisé était le Pacific Blue (Molecular Probes, Life Technologies) et les cellules ont été fixées. L’acquisition des données a été faite avec le Partec CyFlow ou l’Accuri C6 (BD Biosciences). Lorsque deux anticorps étaient mélangés lors des essais de compétition, seulement la moitié du volume recommandé par test par le manufacturier était utilisée.

4.5.3 Prolifération cellulaire

La prolifération des cellules Jurkat en présence ou en absence de 200ng/mL d’APRIL a été mesurée à l’aide d’une coloration au CellVue Jade (eBioscience) selon les instructions du manufacturier. À la fin du marquage, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS-glucose, comptées et mises en culture. La lecture de la fluorescence de la génération 0 a été faite le jour de la mise en plaque des cellules. La prolifération a été suivie par la détermination de la fluorescence des cellules du jour 0 au jour 3 avec le cytomètre Partec Cy Flow. Les index de prolifération ont été calculés avec le logiciel ModFit (Verity Software House, Topsham, ME, É.-U.). Les données ont été comparées en calculant le pourcentage d’inhibition tel que décrit par Munson et coll. 2010 [146] :

, où I.P. est l’index de prolifération.

4.5.4 Fluorescent Cell Barcoding

4.5.4.1 Lignées cellulaires

La méthode de Fluorescent Cell Barcoding (FCB) a été utilisée afin de suivre simultanément le même intermédiaire de signalisation dans plusieurs conditions. Il s’agit du protocole de FCB standard [147] adapté à notre laboratoire. À moins d’indication contraire, toutes les étapes de lavage ont été effectuées avec du PBS et les incubations ont été faites à la noirceur et à TP. Les cellules U266 et RPMI ont été mises en culture pendant 7 jours dans du milieu RPMI contenant 15 % ou 10 % FBS respectivement et additionné d’APRIL à raison de 200ng/mL. Elles ont été lavées et mises au repos dans leur milieu de culture respectif exempt d’APRIL pendant 18h, avant le début des essais. Après cette période, elles ont été lavées et stimulées en les incubant pendant 20 min dans un milieu IMDM contenant 5 % FBS et 200 ng/mL d’APRIL. Une partie des cellules a été incubée pour la même période dans un milieu exempt d’APRIL et elles ont été utilisées comme

témoins non stimulés. Toutes les cellules ont ensuite été fixées avec du formaldéhyde à 2 % (v/v) (Sigma- Aldrich) et perméabilisées par une incubation de 30 min dans une solution de méthanol à 90 %. Le colorant utilisé pour donner une signature unique à chacune des conditions de l’expérience était le Pacific Blue (Molecular Probes, Life Technologies). Des dilutions de ce colorant ont été préparées avec du DMSO (Sigma- Aldrich); 0,09 M; 0,5 M; 3,1 M et 18,3 M, avec lesquelles les cellules ont été marquées. Les cellules ainsi colorées ont été lavées, mises en suspension dans du méthanol 90 % et incubées pour la nuit à 4 °C. Suite à cette incubation, elles ont été lavées et mises en suspension dans une solution de PBS contenant 1 % de BSA (Fisher Scientific). Les différentes conditions ont par la suite été regroupées dans un même tube et divisées en fraction pour mesurer l’état de phosphorylation de protéines cibles avec les anticorps anti-pERK1- 2, anti-NFB, anti-pP38 et anti-AKT. Tous ces anticorps étaient couplés à Alexa 647 (BD Biosciences). L’acquisition des données a été effectuée avec le cytomètre Partec Cy Flow avec les logiciels indiqués à la section 4.5.1.

4.5.4.2 Plasmocytes générés in vitro

Le même protocole a été appliqué aux plasmocytes générés in vitro, mais avec une matrice 4X2. Ils ont été stimulés avec 50g/mL d’IL-6, d’IL-21, d’IFN- ou de TNF (PeproTech) ou encore du LPS (E. Coli 026:B6, Sigma-Aldrich) à 10g/mL. Ces cellules ont donc été colorées avec deux colorants FCB, soit le Pacific Blue aux concentrations finales décrites à la section 4.5.4.1. Le Dylight 800 NHS (Molecular Probes, Invitrogen) était utilisé à des concentrations finales de 0 M et 0,5 M également dilué dans du DMSO. Les cellules ainsi colorées ont ensuite été marquées avec un anti-CD38 PE-Cy7 et anti-CD138 PE en plus des anticorps suivant couplés à l’Alexa 647 : pSTAT1, pSTAT3, pNFB et pp38 tous provenant de BD Biosciences. L’analyse des données a été faite par l’exclusion des débris dans un graphique SSC/FSC. Cette région a été rapportée sur un graphique CD38/CD138 et la suite des analyses a été faite sur les plasmocytes CD38hi_CD138+_{. Les}

compensations ont été faites avec des billes prévues à cet effet et appliquées aux fichiers qui ont été exportés sur la plateforme d’analyse Cytobank [148]. Des matrices Heat Map ont été générées en utilisant la formule du log2 (MFI stimulées/(MFI non-stimulées moyenne). Le contrôle négatif était constitué de la médiane de fluorescence

d’anti-phosphoprotéines de cellules non-stimulées.