5. Résultats
5.2 Différenciation des lymphocytes B avec l’interaction CD70
5.2.2 Comparaison des interactions CD70 et CD154
5.2.2.1 Phénotype CD38 et CD138
Suite à ces observations, les expérimentations ont été effectuées afin de déterminer si une faible interaction avec CD70 induisait une meilleure différenciation des lymphocytes B par rapport à l’interaction CD154 en se fiant aux mêmes critères décrits précédemment, soit l’apparition de cellules CD38hiCD138+/- et la sécrétion
d’immunoglobulines. La figure 5.6 montre l’évolution de la présence de CD38 et CD138 sur les cellules vivantes, soit négatives pour le marquage Pacific Blue. Au jour 0, soit le jour de la mise en culture des cellules dans l’environnement de différenciation, environ la moitié des lymphocytes B expansionnés exprimaient le CD38 et 17 ±4 % des cellules l’exprimaient fortement (CD38hi). Cette proportion a augmenté tout au long de la
culture telle que montrée à la figure 5.6 C. Au jour 5, une plus grande proportion de plasmocytes a été générée avec l’interaction CD70. En effet à ce jour, 53 ±7 % des cellules dans cette condition affichaient le phénotype CD38hi tandis que cette proportion était de 35 ±6 % avec l’interaction CD154 (p value= 0,0260; test
Mann-Whitney). Ces profils d’expression ont évolué durant la culture et les deux conditions donnaient lieu à des proportions de cellules CD38hi et CD138+ similaires après 14 jours de culture (Fig. 5.6B et C). En effet, la
quantité de plasmocytes CD138+ au début de la culture était de 5 ±2 %. Cette fréquence a rapidement monté
après seulement 5 jours de culture et était de 29 ±2 % chez les cellules cultivées en interaction CD70 et de 19 ±3 % en CD154. La fréquence de ces plasmocytes dans cette condition était plus faible que dans la condition CD70 après 14 jours de culture. Cette dernière a permis la génération de 37±5 % CD138+ alors que
Figure 5.6 Émergence de cellules CD38hiCD138+. Les résultats sont présentés comme des moyennes
erreurs moyennes standards de six expériences indépendantes. (A) Profil d’expression de CD38 et CD138 aux jours 0, 5 et 14 des cultures cellulaires en interactions CD70 ou CD154. Les cellules analysées ont été ciblées sur la région des cellules vivantes (Pacific blue négatives). (B) Fréquence de cellules CD38hi dans les
conditions à l’étude. La comparaison de la quantité de cellules CD38hi au jour 5 entre les deux conditions a été
faite avec le test de Mann-Whitney, avec un p value de 0,0260. Pour le suivi de l’apparition de cellules CD138+. (C), le test de Kruskal-Wallis a été utilisé (*p < 0,05; **p <0,01; ***p <0,001).
5.2.2.2 Sécrétion d’immunoglobulines
La confirmation de la différenciation des cellules s’appuie par leur fonction de sécrétion d’immunoglobulines, cette caractéristique a été comparée chez les cellules cultivées dans chacune des conditions d’intérêt sur des surnageants de culture prélevés aux jours 5 et 14. Après cinq jours de culture, les deux interactions cellulaires ont donné lieu à des niveaux de sécrétion d’immunoglobulines équivalents (Fig. 5.7 A).
0 20 40 60 80 CD70 CD154 CD70 CD154 D0 D5 D14 C e ll u le s C D 3 8 h i (% ) ** ** * *** 0 15 30 45 60 CD70 CD154 CD70 CD154 D0 D5 D14 C e ll u le s C D 1 3 8 + ( % ) ** *** *
B
C
C
D
70
C
D
15
4
CD138 C D 38D0
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104D5
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104D14
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104A
Jour 0
Jour 5
Jour 14
Figure 5.7 Sécrétion d’immunoglobulines. À chaque changement des cellules adhérentes, la moitié du
milieu de culture était prélevé et gardé stérile pour des essais de mesure de la sécrétion des cellules. (A) Jour 5 (B) Jour 14. Les concentrations d’immunoglobulines relatives ont été déterminées pour ces deux jours(C) Jour 5 (D) Jour 14. Cette concentration a été déterminée en normalisant la concentration d’Ig sécrétée par la quantité totale de cellules vivantes au jour 5.
Comme attendu, les IgA et les sous-classes d’IgG étaient les immunoglobulines sécrétées en plus grande quantité, avec 244 ± 137g/mL et 211 ± 112g/mL d’IgA avec l’interaction CD70 et CD154 respectivement.
Les IgG1 étaient les plus abondants parmi les sous-classes d’IgG, avec une concentration s’élevant à 51 ± 10g/mL suivant l’interaction CD70 et 59 ± 17g/mL suite à la culture de cellules avec l’interaction CD154 au jour 5 (Fig. 5.7 A).
Au jour 14, la concentration en IgG1 était plus élevée dans les surnageants de cultures faites avec l’interaction CD154 (51 ± 10g/mL par rapport à 29 ± 4g/mL). De plus, la sécrétion d’IgG3 avec l’interaction CD154 (17 ± 4g/mL) était deux fois plus élevée qu’avec l’interaction CD70 (7 ± 2g/mL) (Fig 5.7 B). Étant donné que la concentration cellulaire était différente lors des cultures dans les deux conditions, la sécrétion relative a été calculée (Fig. 5.7 C et D), en normalisant la concentration d’Ig sécrétée avec la quantité totale de cellules au jour 5 dans chacune des conditions. La sécrétion d’Ig au jour 14 est donc semblable dans les deux conditions lorsque l’on tient compte de la quantité de cellules, tel que montré par la sécrétion relative d’IgG1 qui était de 5 ± 1g/106 cellules avec interaction CD70 par rapport à 6 ± 1g/106 cellules pour l’interaction CD154.
5.2.2.3 Évolution de l’expression des molécules CD27 et CD70
Étant donné l’importance du marqueur CD27 pour répondre à l’interaction de CD70, un suivi de l’évolution de ce marqueur durant la différenciation des cellules a été effectué (Fig. 5.8). De plus, une des caractéristiques des plasmocytes est aussi la forte expression du CD27 [50] ce qui rend l’étude de ce marqueur important. La proportion de cellules CD27+ dans la culture augmentait de jour en jour, et ce, avec les deux interactions
d’intérêt. Au jour 14, cette fréquence atteignait 60 ±5 % et 75 ±7 % avec l’interaction CD70 et CD154 respectivement. En moyenne, la proportion de ces cellules était de 17±3 % au moment de la mise en culture des cellules. L’intensité de fluorescence de ce marqueur augmentait de façon constante sur les cellules cultivées avec l’interaction CD154. Quant aux cellules cultivées en interaction CD70, l’intensité de fluorescence du CD27 augmentait légèrement entre le jour 0 et 5 mais diminuait après ce jour, passant de 7859 à 5916. Cette expression est deux fois plus faible que celle observée sur les cellules cultivées avec l’interaction CD154, dont l’intensité de fluorescence était de 13227. Cette différence n’était toutefois pas significative (p value =0,0952, test Mann-Whitney).
Figure 5.8 Expression de CD27. L’intensité de fluorescence (médiane d’intensité de fluorescence) du CD27
(A) ainsi que la fréquence de cellules CD27+ (B) ont été mesurées tout au long des cultures. Les valeurs
présentées sont les moyennes erreurs moyennes standards obtenues d’expériences indépendantes (n=3 pour les jours 0 et 5, n=6 pour le jour 14).
Figure 5.9 Évolution de l’expression de CD27 et CD70. Ces graphiques présentés sont représentatifs de
trois expériences indépendantes. (A) Profil d’expression au jour 0. Les proportions de chacune des régions sont la moyenne obtenue pour les 3 expériences effectuées. R1 : cellules CD70+CD27-; R2 : CD70lowCD27-;
R3 : CD70-CD27+ (B) Profil d’expression au jour 14.
Le ligand du CD27 est le CD70. Celui-ci est connu pour être exprimé sur les lymphocytes B [142]. Il était donc important de suivre l’évolution de l’expression de ce marqueur de surface. Le marquage fait sur les cellules au jour 0 (Fig. 5.9 A) a montré que trois populations cellulaires étaient présentes lors de l’analyse simultanée de ce marqueur et du CD27. En effet, le tiers des cellules (33 2 %) étaient de phénotype CD70+CD27-. Une
plus faible proportion (21±2 %) exprimait plus faiblement le CD70 sans exprimer le CD27 (CD70loCD27-). Un
autre tiers des cellules (28±2 %) exprimait uniquement le CD27 (CD70-CD27+). L’étude ces marqueurs de
surface au jour 14 (Fig. 5.9 B) a montré qu’il y a eu un mouvement des cellules vers une plus grande expression du CD27 tandis qu’elles perdaient l’expression de son ligand, le CD70. Tel que montré à la figure 5.8, 60 5 % et 75 ±7 % des cellules cultivées avec les interactions CD70 et CD154 respectivement exprimaient le CD27.
5.2.2.4 Prolifération et viabilité
La différenciation cellulaire induite par la culture des lymphocytes B a des effets non seulement au niveau de l’expression de marqueurs de surface et de la sécrétion d’immunoglobulines, tel qu’observé précédemment, mais la croissance cellulaire peut aussi s’en trouver affectée. Les comptes cellulaires effectués lors des changements des cellules-supports CD70+ ou CD154+ ont permis de suivre la prolifération, l’expansion ainsi
que la viabilité des cellules en culture. Dans les deux conditions à l’étude, le pic de la prolifération cellulaire se trouve au jour 5, où il est d’un facteur d’expansion de 1,3 0,4 et de 1,8 0,4 avec l’interaction CD70 et CD154 respectivement. Le taux de prolifération des cellules diminue à partir de ce jour et le plus faible taux est calculé au jour 14 pour les deux conditions. Au jour 9, le taux de prolifération des cellules cultivées avec l’interaction CD154 est toutefois deux fois supérieur qu’avec l’interaction CD70, soit 1,5 0,3 par rapport à 0,6 0,1 et cette différence est significative (test Mann-Whitney, p value= 0,0087).
L’expansion cellulaire avait un profil légèrement différent. En effet, elle augmentait pour les cellules dans les deux conditions, mais le pic n’était pas au même moment. Dans le cas de l’interaction CD70, l’expansion maximale des cellules (1,3 0,3) a été observée 5 jours après le début de la culture tandis que celle des cellules en interaction CD154 était au jour 9 (2,7 0,8). Non seulement le moment du pic d’expansion était différent dans les deux conditions, mais l’expansion cellulaire était toujours plus élevée chez les cellules cultivées en CD154. Après 5 jours de culture, elle était trois fois supérieure que celle des cellules en interaction CD70 (différence non significative selon le test Mann-Whitney, p value= 0,0931). Cette différence était d’autant plus grande à la fin de la culture (jour 14), où l’expansion des cellules en interaction CD154 était 6 fois supérieure. Cette différence était significative, avec un p value de 0,0260 avec le test Mann-Whitney. Une caractéristique importante des cellules en culture est leur viabilité. Tel que montré à la figure 5.10 C, celle-ci baisse drastiquement dans les deux conditions à l’étude à partir du jour 5. En moyenne, les cultures étaient démarrées avec des cellules ayant 74 ±2 % de viabilité. Après 14 jours de culture, cette valeur était en moyenne de 33 5 % et de 37 7 % avec les interactions cellulaires CD70 et CD154 respectivement.
Figure 5.10 Croissance des cellules. Les données sont présentées comme des moyennes erreurs standard moyennes de 6 expériences indépendantes. Pour les comparaisons entre les conditions, le test Mann-Whitney a été utilisé. (A) Taux de prolifération. Différence significative entre les conditions au jour 9, p value= 0,0087 (B) Expansion. Différence significative au jour 14, p value= 0,026 (C) Viabilité cellulaire.
5.2.2.5 Comparaison globale de l’effet de CD70 et CD154 lors de la phase de différenciation
Cette série d’expérimentations ciblant l’effet des interactions CD70 et CD154 sur la différenciation des lymphocytes B mémoires expansionnés a été menée en suivant l’émergence de cellules CD38hiCD138+/-, la
sécrétion d’immunoglobulines, l’expression de CD27 ainsi que l’évolution des cellules en culture. Il en est ressorti que l’interaction avec CD70 induit une émergence rapide de plus de cellules CD38hi après 5 jours de
culture. La quantité de cellules différenciées en fonction de l’expression de CD38 et de CD138 est toutefois similaire dans les deux conditions de culture après 14 jours. De plus, aucune différence n’a été observée sur la capacité sécrétrice des cellules dans chacune des conditions, que ce soit d’IgA, d’IgE, IgM, ou des sous- classes d’IgG.
D’un autre côté, lors de ces essais le niveau d’expression de CD27 augmentait au fur et à mesure dans les cultures tout en demeurant plus élevé avec l’interaction CD154. L’évaluation de l’expression de CD70 a de plus mis en lumière un profil d’expression inverse entre celui-ci et le CD27. En effet, la plupart des cellules exprimaient uniquement le CD70 au jour 0, alors que 60 à 75 % d’entre elles exprimaient le marqueur CD27 en fin de culture.
Au point de vue de l’activité globale, les comptes cellulaires effectués durant les cultures ont permis de suivre la prolifération, l’expansion et la viabilité cellulaire. Une différence significative a été notée dans le taux de prolifération des cellules au jour 9 en faveur de l’interaction CD154 et ces cellules avaient une meilleure expansion en fin de culture. La viabilité cellulaire dans les deux conditions était similaire, mais diminuait au fur et à mesure des cultures. Une faible viabilité en fin de culture ne donnant pas la possibilité de faire beaucoup d’analyses avec les cellules générées. Il était donc nécessaire de tester des facteurs pouvant améliorer la viabilité des cellules, ce qui pourrait aider à une meilleure comparaison des interactions cellulaires d’intérêt.