5. Résultats
5.3 Amélioration de la viabilité des lymphocytes B
5.3.1 APRIL
5.3.1.1 APRIL n’a pas d’effet sur la viabilité des cellules in vitro
APRIL est l’une des plus importantes molécules connues pour la survie des plasmocytes [101]. L’étude de son effet de survie in vitro sur des cultures de lymphocytes B a débuté par une dose-réponse, afin de déterminer la concentration optimale de cette molécule qui permettrait d’améliorer la viabilité des cellules. Dans le cadre de cet essai, des doses allant de 0 à 200 ng/mL d’APRIL recombinante ont été testées sur des cellules cultivées avec l’interaction CD70 utilisée à un ratio 1:20 pendant 14 jours. APRIL a été introduite dans les cultures au jour 7. Tel que montré à la figure 5.11, aucune des concentrations utilisées dans la dose réponse n’a semblé augmenter la viabilité des cellules par rapport à la condition contrôle, soit en absence d’APRIL. La viabilité dans toutes les conditions était inférieure à 75 %. Les meilleures viabilités obtenues au jour 14 étaient de 68 % avec 100 ng/mL et 65 % avec 25 ng/mL. Il n’y avait donc pas de lien entre la viabilité cellulaire et la concentration d’APRIL utilisée dans le milieu de culture des cellules. Pour s’assurer que cette indifférence n’avait pas un lien avec l’interaction cellulaire utilisée lors de cet essai, une expérience comparant la viabilité des cellules cultivées avec l’interaction CD154 en présence ou non d’APRIL a été faite. La concentration de 200 ng/mL a été utilisée pour s’assurer donner un signal maximal de survie aux cellules en culture.
Figure 5.11 Dose-réponse d’APRIL. Les cellules ont été cultivées en interaction CD27-CD70 ratio 1:20
pendant 14 jours. Les différentes concentrations d’APRIL ont été introduites lors du changement de milieu au jour 7 ce qui a permis une évaluation de la viabilité au jour 9. n=1
Figure 5.12 : Effet d’APRIL sur la viabilité cellulaire en interaction CD70 et CD154. Viabilité mesurée à
J=9. La ligne pointillée indique la viabilité au jour 0 (86 %) de la phase de différenciation. La culture a été faite avec 200 ng/mL d’APRIL introduite dans les conditions données entre le jour 4 et le jour 9. Cet essai a été réalisé une seule fois. La condition contrôle ne contenait pas d’APRIL.
Tel que montré à la figure 5.12, l’interaction cellulaire utilisée ne semble pas impliquée au niveau de la viabilité des cellules cultivées en présence d’APRIL. En effet, dans le cadre de cette expérience, on observe une baisse de la viabilité dans toutes les conditions à l’étude par rapport à la viabilité cellulaire au jour 0 (86 %). Cette molécule ne semble pas non plus avoir d’effet sur de la différenciation des cellules au niveau de la sécrétion d’IgG et d’IgA. Bien que la sécrétion d’IgG varie entre 101 et 133 g/mL et que celui d’IgA varie entre 26 et 31 g/mL, il n’y a pas de différence notable sur le niveau de sécrétion de ces immunoglobulines (Fig. 5.13 A) parmi les conditions à l’étude. La même observation est faite au niveau de la quantité de cellules sécrétrices d’IgG (Fig. 5.13 B). Il n’y avait pas de différence au niveau de la quantité de cellules sécrétrices d’anticorps entre les milieux contenant ou non de l’APRIL. De plus, une analyse en cytométrie en flux de la quantité de plasmocytes CD138+ générée a montré que la proportion de cette population n’était pas influencée
par la présence d’APRIL dans le milieu de culture (résultats non montrés).
Ces observations n’étant pas en accord avec les études publiées, deux possibilités ont été testées d’une part, se pourrait-il qu’une des composantes du milieu de culture inhibe l’effet d’APRIL? D’autre part, les cellules en culture ont-elles les récepteurs nécessaires pour répondre à cette molécule? Dans le système de culture à l’étude, la phase de différenciation se déroule en présence des interleukines 6 et 10. La première est principalement connue comme étant un facteur important dans la différenciation des lymphocytes B [153] tandis que le dernier est un facteur de survie cellulaire [154].
0 25 50 75 100
Contrôle APRIL Contrôle APRIL
CD70 CD154
V
ia
b
ili
té
(
%
)
Figure 5.13 Effet d’APRIL sur la fonction sécrétrice des lymphocytes B. Ces essais ont été effectués au
jour 9 de la culture. (A) La sécrétion d’IgG et d’IgA a été évaluée par ELISA sur les surnageants de culture. (B) La quantité de cellules sécrétrices d’IgG a été évaluée dans chaque condition par ELISPOT en ratio par rapport au nombre de cellules viables en culture.
Étant donné que l’IL-10 a un rôle redondant avec APRIL dans le système de culture, la présence simultanée de ces deux facteurs pourrait contrecarrer l’effet d’APRIL. Afin d’étudier cette possibilité, les cellules ont été cultivées avec l’un ou l’autre des interactions cellulaires d’intérêt, en présence d’APRIL, avec ou sans IL-10, sur une période de 14 jours (Fig. 5.14). Dans toutes les conditions, la viabilité des cellules a diminué au fur et à mesure de la culture et était autour de 50 % au jour 14. Il s’est avéré que la présence d’APRIL ne permettait pas de maintenir une bonne viabilité des cellules après leur mise en culture et la présence ou l’absence d’IL- 10 n’était pas la cause de ce résultat. Dans le cadre de cette expérience, APRIL a été introduite dans le milieu de culture en début de la phase de différenciation, à une concentration de 25 ng/mL, au lieu de 200ng/mL telle que montrée à la figure 5.12. Malgré cela, les conclusions demeurent les mêmes, soit de la diminution de la viabilité des cellules.
0 10 20 30 40
APRIL Contrôle APRIL Contrôle
CD70 CD154
C
el
lu
le
s
sé
c
ré
tr
ic
e
s
d
'Ig
G
(
%
)
0 40 80 120 160APRIL Contrôle APRIL Contrôle
CD70 CD154
S
éc
ré
ti
o
n
(
µ
g
/m
L
)
IgG
IgA
A
B
Figure 5.14 Effet de la présence simultanée d’APRIL et d’IL-10 sur la viabilité cellulaire. Les cellules ont
été cultivées avec 25 ng/mL d’APRIL dès le début la culture cellulaire, pendant 14 jours avec l’interaction CD70 ou CD154. Ce résultat est représentatif d’une expérience.
In vivo, APRIL induit ses effets à travers son interaction avec ses récepteurs qui sont au nombre de quatre. Il s’agit du BCMA (B Cell Maturation Antigen), TACI (Transmembrane Activator and Calcium Modulator and
Cyclophilin Ligand Interactor) et des protéoglycanes à héparanes sulfates [106] [155]. Une variante d’APRIL
peut aussi lier BAFF-R avec une faible affinité [107]. Un marquage de cytométrie en flux a été effectué sur des cellules cultivées en présence d’APRIL, afin d’étudier la présence des récepteurs BCMA et TACI.
Tel que montré à la figure 5.15, la proportion de cellules BCMA+ est deux fois supérieure parmi les cellules
cultivées en interaction CD70 par rapport aux cellules cultivées en interaction CD154. Toutefois, la présence simultanée d’APRIL et d’IL-10 n’influence pas l’expression de ce récepteur parmi les cellules cultivées avec l’une ou l’autre des interactions. Dans toutes les conditions à l’étude, la proportion de cellules TACI+ est
toujours inférieure à celles exprimant BCMA. Il est à noter que la proportion de cellules BCMA+ après 14 jours
de culture est de près de 21 %, parmi les cellules cultivées avec l’interaction CD70 et en absence d’IL-10. C’est cependant dans cette même condition qu’on retrouve la plus grande proportion de cellules TACI+, soit
15 %. En somme, même après une culture de 14 jours de cellules en présence d’APRIL, moins de 20 % des cellules expriment ces récepteurs. Cette observation pourrait expliquer le peu d’influence d’APRIL dans ces conditions, puisque la majorité des cellules ne pouvaient pas y répondre. Ce phénotype peut être aussi illustré au niveau de l’intensité de fluorescence de ces deux marqueurs (Fig. 5.15 B). L’intensité de fluorescence corrèle avec la proportion de cellules exprimant l’un ou l’autre des récepteurs. Étant donné que les deux anticorps étaient couplés au même fluorochrome, il est possible de comparer directement les intensités de fluorescence obtenues.
Figure 5.15 Expression des récepteurs d’APRIL. Marquage extracellulaire en cytométrie en flux sur des
cellules cultivées 14 jours en présence d’APRIL et/oud’IL-10. Cet essai a été réalisé une seule fois. Les deux anticorps étaient couplés au PE. (A) Fréquence des cellules exprimant les récepteurs BCMA et TACI (B) Intensité de fluorescence de BCMA et de TACI.
En résumé, nous n’avons pas pu observer un effet induit par APRIL sur les cellules en culture, que ce soit au niveau de la viabilité cellulaire, de leurs fonctions sécrétrices, de leur différenciation phénotypique ou encore au niveau de la modulation de l’expression des récepteurs de ce facteur soluble.
5.3.1.2 Mesure de l’activité biologique d’APRIL
Suite à ces observations, il était important de s’assurer que la molécule recombinante d’APRIL utilisée dans les cultures était bien fonctionnelle et avait une activité biologique. Une mesure de l’activité biologique d’APRIL a été menée à travers l’étude de la signalisation intracellulaire induite par cette molécule ainsi que son effet sur la prolifération d’une lignée cellulaire. La liaison d’APRIL à BCMA ou TACI, induit la phosphorylation de plusieurs protéines de signalisation. Dans les essais in vitro, nous avons testé ce phénomène sur deux lignées
A
B
BCMA TACIC
o
m
pt
e
Cellules non-marquées CD70 +IL-10 CD154 +IL-10 CD70 CD154TACI
Co
mp
te
BCMA BCMA TACICo
mp
te
B
Cellules non-marquées Contrôle APRILA
cellulaires, soit les cellules U266 et RPMI qui expriment les récepteurs TACI et BCMA [155]. Ces cellules ont été cultivées pendant 7 jours en présence ou en absence de 200 ng/mL d’APRIL.
Figure 5.16 Expression de TACI et BCMA sur lignées cellulaires. Un marquage extracellulaire effectué
après la culture des cellules dans un milieu contenant 200 ng/mL d’APRIL, après 14 jours. Les deux anticorps étaient couplés au PE. (A) U266 (B) RPMI-8226
L’expression de TACI et de BCMA a été mesurée par cytométrie en flux sur les cellules U266 (Fig. 5.16 A) et les cellules RPMI-8226 (Fig. 5.16 B). Pour les deux lignées cellulaires, TACI était exprimé par 24 % des cellules U266 et 12 % des cellules RPMI-8226. La culture de ces lignées avec APRIL ne semblait pas en influencer son expression, étant donné les proportions semblables de 21 % et 15 % de cellules TACI+ chez les
cellules U266 et RPMI-8226 respectivement. De plus, la présence d’APRIL ne semblait pas modifier l’expression de BCMA sur ces deux lignées. La proportion de cellules BCMA+ était de 57 % et 60 % pour les
cellules U266 et RPMI-8226 respectivement.
Après les 7 jours de culture, les cellules U266 et RPMI-8226 ont été mises au repos dans du milieu ne contenant pas d’APRIL pendant 18h après quoi, elles ont été restimulées pendant 20 min avec 200 ng/mL d’APRIL et le niveau de phosphorylation des protéines cibles dans la voie de signalisation induite par APRIL (ERK ½, AKT, NFkB et p38) a été mesuré. Aucune conclusion n’a pu être tirée suite à ces essais étant donné que la présence d’APRIL (pendant 7 jours ou 20 min) n’a pas induit la phosphorylation d’aucune protéine cible chez les U266 ou les RPMI (résultats non montrés).
Étant donné que les observations précédentes ne permettaient pas de conclure que la source de APRIL était biologiquement active, une autre activité d’APRIL a été testée, soit son effet positif sur la prolifération d’une lignée de lymphocytes T, les Jurkat. L’activité biologique de ce facteur soluble a donc été testée en cultivant ces cellules en présence ou en absence de 200 ng/mL d’APRIL sur une période de 72h. L’essai a été mené en duplicata et la prolifération cellulaire a été mesurée après 24h, 48h et 72h, en cytométrie en flux par un marquage avec le CellVue. Les taux de prolifération obtenus ont permis le calcul du pourcentage d’inhibition [146]. Il a été observé que la prolifération des cellules cultivées avec APRIL avait une meilleure prolifération après 24h, comparativement aux cellules contrôles avec une inhibition de 13 5 %. Ce résultat suggère que la molécule d’APRIL utilisée dans nos essais avait bien une activité biologique.