La culture de Staphylococcus aureus se fait sur gélose ordinaire dans la majorité des cas ou sur milieu de culture sélectif si le prélèvement est fortement contaminé par d'autres bactéries [211], alors que la culture de Propionibacterium acnes s’effectue sur des milieux de type gélose au sang [65].
-Milieux sélectifs utilisés dans l'isolement de Staphylococcus aureus :
milieu de chapman (Figure 58) est un milieu gélosé hypersalé (7,5% de NaCl), contenant du mannitol [43], et un indicateur de pH [211] (Rouge de phénol qui vire du rose au jaune) [212]. Après incubation de 24 à 48 heures, une croissance abondante de
Staphylococcus aureus est observée, les colonies sont entourées d’un halo jaune puisqu’elles
fermentent le mannitol, tout comme parfois Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus
epidermidis et Staphylococcus cohnii.
milieux gélosés Columbia CNA (colistine et acide nalidixique) ou CAT (colistine et aztréonam) inhibent les bactéries à Gram négatif et permettent la culture des bactéries à Gram positif, cocci tel que les Staphylococcus aureus (Figure 59) ou bacilles [43]. Ces milieux sont rendues sélectifs par addition d’antibiotiques [214].
Figure 59 : Isolement de Staphylococcus aureus sur gélose Columbia à 5% de sang de mouton [43].
A noter que la culture de Staphylococcus aureus se fait généralement sur gélose
columbia de CNA additionnée au sang de mouton (5%) et incubée à 37°C pendant 24 à 48 heures sous dioxyde de carbone ou en anaérobiose [51].
milieu de Baird-Parker est à base de tellurite de potassium et de jaune d’œuf. Sur ce milieu, les Staphylococcus aureus se présentent sous forme de colonies noires dues à la réduction du tellurite avec un halo clair autour résultant de la protéolyse, suivi d’une opacification tardive du halo par production de lipase (figure 60). Ce milieu est surtout utilisé en bactériologie alimentaire.
Figure 60 : Staphylococcus aureus sur milieu de Baird-Parker agar [215].
milieux à substrats chromogènes [43] : La plupart des fabricants de milieux gélosés ont développé [214] des systèmes permettant l’identification directe des Staphylococcus
aureus en fonction de la positivité de la culture et de la couleur des colonies obtenues sur ces
milieux spécifiques «Milieux chromogènes» [43].
A noter que sur le milieu chromogène (CHROMagar Staph aureus®), la pigmentation
rose des colonies de Staphylococcus aureus après 24 h d’incubation à 37 °C permet d’isoler et de détecter Staphylococcus aureus dans les prélèvements plurimicrobiens avec une sensibilité de 98,5 % et une spécificité de 97 % [216, 217].
-Milieux utilisés dans l'isolement de Propionibacterium acnes :
Géloses au sang frais sont des géloses enrichies, obtenues en ajoutant à des géloses ordinaires 5 à 10 % du sang frais. Ils permettent la croissance et l’isolement des bactéries exigeantes grâce à la présence de facteurs de croissance contenus dans le sang [214]. La culture de Propionibacterium acnes s’effectue sur géloses au sang de mouton [218],
Milieu gélosé contenant des antibiotiques [218] sélectif pour les
Propionibacterium acnes «Gélose Columbia+CNA» : est un milieu gélosé Columbia,
additionné de 5 % de sang de mouton que l’on a rendu sélectif pour les bactéries anaérobies à Gram positif en lui ajoutant des antibiotiques ANC (acide nalidixique et colistine).
A noter qu’il est nécessaire de préréduire les milieux en les plaçant en anaérobiose
quelques heures avant leur utilisation [219].
-Milieux utilisés dans l’étude de la sensibilité aux antibiotiques :
Gélose de Mueller-Hinton (MH) est un milieu utilisé pour tester la sensibilité des bactéries aux antibiotiques (Figure 61), et dont l’utilisation est recommandée par le Comité de l’Antibiogramme de la société Française de Microbiologie (CA-SFM) [206].
Gélose de Wilkins Chalgren(WC) est un milieu utilisé pour la croissance et pour tester la sensibilité des bactéries anaérobies aux antibiotiques [214].
A noter que les milieux de MH et de WC peuvent être supplémentés avec du sang frais
ou cuit [214].
P : Pénicilline, M : Methicilline, VA : Vancomycine TE : Tétracycline, E : Érythromycine
-Milieux pour la galerie classique LeMinor :
Citrate de Simmons [221] :
Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate comme seule source de carbone et d'énergie. Ce caractère est intéressant pour discriminer les bactéries entre-elles et ainsi de les identifier. Le substrat ici est le citrate. Il est ici la seule source de carbone et d'énergie pour la bactérie (figure 62).
Lecture :
La présence de colonies le long de la strie centrale d'ensemencement sera la preuve d'un développement bactérien, ce qui traduira le fait que la bactérie est capable d'utiliser le citrate comme seule source de carbone et d'énergie. La présence d'un indicateur coloré de pH comme le bleu de bromothymol permettra de mettre en évidence une alcalinisation en cas d'utilisation du citrate.
A et C : citrate (+) B et D : citrate (-) Figure 62 : Milieu de citrate de Simmons [221].
Milieu Lactose-Glucose-H2S (KLIGLER-HAJNA) [222] :
Après avoir ensemencé la surface de la pente de gélose par des stries et le culot par piqûre centrale [214], ce milieu donne quatre réponses en 24 heures maximum:
3- Production de H2S (sulfure d'hydrogène). 4- Production du gaz.
Lecture :
-Pour la fermentation de lactose : La surface inclinée vire au jaune. Dans le cas contraire, sa couleur reste inchangée.
-Pour la fermentation de glucose : le culot vire au jaune. Dans le cas contraire, sa couleur reste inchangée (Rouge).
-S’il y a production de gaz, il est possible d’observer, soit seulement quelques bulles, soit une poche gazeuse qui décolle complètement le milieu du fond du tube (figure 63-B).
-Pour la production de H2S se traduit par un noircissement du milieu dans la zone joignant le culot à la pente (figure 63-B).
A) Milieu de Kligler-Hajna non ensemencé.
B) De gauche à droite, bactérie glucose +, lactose +, productrice de gaz; bactérie glucose +, lactose –, H2S +, productrice de gaz ; bactérie glucose +, lactose –, H2S + (faiblement) [214].
Milieu mannitol-mobilité-nitrate [223]
Il s’agit d’un milieu semi-solide contenant entre autre du mannitol, du rouge de phénol comme indicateur de pH (figure 64). Après régénération au bain-marie bouillant pendant 20 min, le milieu est refroidi totalement puis ensemencé par piqûre centrale.
Lecture :
-Lorsque l’indicateur coloré passe du rouge au jaune, cela veut dire que le mannitol a été utilisé. Le caractère mobile est défini dans ce milieu par un trouble envahissant toute la largeur de la gélose de part et d’autres de la piqûre centrale, alors qu’une bactérie immobile ne se développe que le long de la piqûre centrale. Le type respiratoire est défini en ajoutant, à la surface du milieu, les réactifs de GRIESS* (acide sulfanilique et alphanaphtylamine). Il est possible de mettre en évidence le nitrite, si la bactérie possède une nitrate-réductase.
Figure 64 : Milieu mannitol-mobilité-nitrate [224].
L.D.C (lysine-décarboxylase selon Taylor) [225] :
Le milieu à la lysine de Taylor est un milieu liquide utilisé pour la recherche de la lysine décarboxylase (figure 65).
Lecture :
- En cas de coloration jaune bleuté, poursuivre l’incubation pendant 24 heures supplémentaires.
Figure 65 : Milieu du lysine-décarboxylase selon Taylor [206].
Viande foie [226] :
C’est un milieu semi-solide (figure 66), gélosé à 6% et utilisé pour la recherche du mode respiratoire des bactéries, ainsi que pour l’isolement en profondeur des anaérobies.
Lecture :
Après incubation nécessaire au développement bactérien, il est possible de reconnaître 4 principaux types du mode respiratoire :
-Aérobies stricts, qui cultivent uniquement dans la zone superficielle ;
-Anaérobies stricts, qui cultivent uniquement en profondeur (c’est le cas pour
Propionibacterium acnes);
Figure 66 : Milieu viande foie avec des bactéries productrices (1) et non productrices du gaz (2) [227].
Milieu Urée-Indole [228]:
C’est un milieu liquide (figure 67) utilisé pour la recherche de l’uréase, de la tryptophane-désaminase (TDA), et de la production d’indole.
b-Ensemencement et méthodes d’isolement
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés à partir d’un milieu de culture mère. Il est en général effectué avec une anse en platine (figure 68) ou une pipette Pasteur (figure 69).
L’anse en platine Les pipettes pasteurs
Figure 68 : Une anse en platine [206] Figure 69 : Pipettes pasteur [206]
La méthode d’ensemencement utilisée est la méthode d’ensemencement en quadrant (figure 70) selon le schéma suivant :
Ce mode d’ensemencement permet d’isoler les différentes bactéries contenues dans un mélange. Le dépôt de l’échantillon ou de la suspension de germe est effectué près d’un bord de la boîte de pétri, ou une strie dans un quart de la boîte qui constituera le premier quadrant.
Un isolement est effectué à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée à usage unique ou d’une anse en platine (réutilisable) [229]. Que ça soit l’anse ou la pipette pasteur le passage préalable dans la flamme est obligatoire pour éviter toute contamination de la souche.
Ainsi, par cette méthode, le dernier quadrant contient des colonies isolées dont la morphologie permet de s’orienter vers une espèce ou un genre bactérien voire une famille de bactérie.
C’est à partir de ces colonies isolées que des tests d’identification pourront être pratiqués et des tests de sensibilité aux antibiotiques pourront être testés [206].
A noter que l’ensemencement des anaérobies se fait rapidement sur des milieux
préparés extemporanément ou sur des géloses stockées en chambre à anaérobies [230].
c-Incubation [67]
En bactériologie, l'incubation correspond au passage d'une culture dans une étuve à une température optimale et pendant une durée déterminée, afin de conférer aux bactéries les conditions favorables qui leurs permettent de pousser sur tel ou tel milieu de culture [206].
L’incubation des Propionibacterium acnes ensemencées sur milieu gélose au sang, se fait dans une étuve à une température de 37°C [206] pendant 3 à 5 jours [66] (croissance lente) voire même 15 à 20 jours [231], avec un délai d’apparition des cultures de 48 à 72 heures [66], elles se développent dans une atmosphère anaérobie, et peuvent se développer en microaérophilie, et parfois en atmosphère alimentée de 5% de CO2 (notion d’aérotolérance) [65]. Alors que l’incubation des Staphylococcus aureus ensemencées sur milieu Chapman, des galeries API (Appareillage et Procédés d’Identification) «20 Staph®, Api 20 A (anaérobie strict) » et de Galerie classique (leMinor) s’effectue dans une étuve à une température de
VII-1-3-4-Identification
L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caractères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce bactérienne donnée [206].
a-Aspect des colonies :
Après incubation, le premier critère d’identification sur lequel on se base est celle de l’aspect macroscopique des colonies vu à l’œil nu [206].
Sur milieux ordinaires ou usuels, les colonies de Staphylocoques mesurent 1 à 2 mm de diamètre, elles sont lisses, rondes, opaques et bombées. La pigmentation des colonies peut varier du blanc au jaune doré ou jaune citrin (figure 71). Sur gélose au sang, les souches « typiques » de Staphylococcus aureus peuvent produire des colonies de couleur jaune doré, entourées d’une hémolyse β (figure 72) [43].
Figure 71 : Culture de Staphylococcus aureus sur milieu Chapman réalisée au laboratoire de bactériologie, IPM-Casablanca-2014/ BOULIF Hakima
Figure 72 : Culture de Staphylococcus aureus sur gélose au sang [232].
Les colonies de Propionibacterium acnes apparaissent au bout de plusieurs jours allant de 10 à 15 jours [65], elles sont en général petites, parfois à la limite de la visibilité, comparativement à celles de staphylocoque [202]. Ces colonies sont fines [218] en tête d'épingle, lisses, blanchâtres ou rose à rouge pâle (figure 73) [65], quelques souches sont β hémolytiques sur gélose au sang de mouton [218].
c-Galeries :
API® Staph est un système standardisé pour l’identification des cocci à
Gram positif «Staphylocoques», comprenant des tests biochimiques miniaturisés ainsi qu’une base de données. La galerie API ® Staph comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne homogène qui reconstitue les milieux [235], obtenue par le mélange d’API Staph Medium et de la souche à tester [51].
L’inoculum nécessaire doit être prélevé sur une culture pure à partir de plusieurs colonies pour obtenir un résultat reproductible et éviter de sélectionner une sous-population [235].
Les réactions produites pendant la période d'incubation (18-24 heures) se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs [235] (NIT1 et NIT2, ZYMA et ZYMB, VP1 et VP2) [51] (figure 74-A). La lecture de ces réactions se fait à l'aide du tableau de lecture (Tableau IV) [206] et l'identification (figure 74-B) est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique API® STAPH [235].
GLU : D-GLUcose, FRU : D-FRUctose, MNE : D-ManNosE, MAL : D-MALtose, LAC : D-LACtose, TRE : D-TREhalose, MAN : D-MANnitol, XLT : XyLiTol, MEL : D-MELibiose, NIT : NITrate de potassium, PAL : Phosphatase ALcaline,
VP: Voges Proskauer, RAF : RAFfinose, XYL : XYLose, SAC : SACcharose, MDG : Méthyl-αD-Glucopyranoside, NAG : N-Acétyl-Glucosamine, ADH : Arginine DiHydrolase, URE : UREase.
La galerie API 20 Staph permet la recherche de : .Réduction des Nitrates en nitrites (NO3)
.Phosphatase Alcaline
.Production d’acétyl méthyl-carbinol (Voges Proskauer) .Arginine Dihydrolase, Uréase
.L’assimilation de : Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Lactose, Tréhalose, Mannitol, Xylitol, Mélibiose, Raffinose, Xylose, Saccharose, Alfa-Methyl-D- Glucoside et N-Acetyl Glucosamine.
Tableau IV : Tableau de lecture de l’Api® staph [235].
Méthode d’étude des bactéries anaérobies strictes (Propionibacterium acnes) :
Microgalerie API 20 A (Anaérobies stricts) est un système qui permet l’identification des
anaérobies stricts (figure 75), il est proche de la galerie API 20 E (Entérobactéries). Les microtubes sont inoculés avec un bouillon « Schaedler » et la révélation des couleurs obtenus s’effectue via des rayonnements UV (figure 76).
Figure 76 : Révélation de galerie anaérobie stricte [236].
Les caractères d’identification des propionibactéries (Propionibacterium acnes) sont la production d’indole, la réduction des nitrates en nitrites [66], la fermentation de
glucose en produisant l’acide propionique et l’acide acétique [65], la non utilisation en anaérobiose du saccharose, du maltose et de l’esculine [218]. Par ailleurs, les
Propionibacterium acnes sont caractérisés par la croissance optimale en anaérobiose [66].
VII-1-3-5-Antibiogramme :
L’antibiogramme est une technique de laboratoire visant à tester la sensibilité d'une souche bactérienne vis-à-vis d'un ou plusieurs antibiotiques supposés ou connus [237], à réévaluer le traitement ou la prophylaxie [238], à identifier les bactéries par la mise en évidence de résistances naturelles, et à surveiller l’épidémiologie de la résistance bactérienne [239].
Le principe consiste à placer la culture de bactéries en présence du ou des antibiotiques et à observer les conséquences sur le développement et la survie de celle-ci. On peut par exemple placer plusieurs pastilles imbibées d'antibiotiques sur une souche bactérienne déposée dans une boîte de Pétri [237]. Cette dernière sera ensuite incubée dans l’étuve à 37°C pendant 18-24 heures.
La lecture de l’antibiogramme et son interprétation se fait conformément aux recommandations des experts du comité d’antibiogramme de la société française de microbiologie (CA-SFM).
Après incubation, autour de chaqu’un des disques on a soit une pousse bactérienne soit une zone d’inhibition. La mesure du diamètre de ces zones nous permet de déterminer le
Lin : lincomycine, Spi : spiramycine, Ery : érythromycine, Cli : clindamycine, Pri : pristinamycine Figure 77 : Antibiogramme de Staphylococcus aureus (méthode des disques Par
diffusion en milieu gélosé) [240].
-Propionibacterium acnes
Les antibiotiques à tester pour les Propionibacterium acnes figurent sur le tableau V :
Résistance naturelle de Propionibacterium acnes :
Propionibacterium acnes est naturellement résistant au métronidazole (MTZ) par
l’absence d’activité pyruvate, empêchant ainsi la formation de composés réduits du MTZ, toxiques pour l’ADN [242].
Résistance acquise de Propionibacterium acnes :
Les antibiotiques topiques et le développement des résistances : l’utilisation dans
l’acné [243] des diverses préparations topiques de galéniques variées contenant des antibiotiques pose le problème d’une facilité d’utilisation qui les expose à une consommation difficilement contrôlable résultante d’une automédication et d’une délivrance sans indication médicale [244]. La sélection de Propionibacterium acnes résistants est possible du fait des difficultés de connaître les concentrations d’antibiotiques délivrés sur une zone cutanée donnée, et ce d’autant qu’il existe un gradient de concentration des antibiotiques du centre vers la périphérie de la zone d’application [245]. Toutefois, le développement des souches résistantes augmente avec la fréquence et avec la durée de l’utilisation qui est parfois très prolongée [246]. C’est pourquoi une étude européenne menée par la société européenne de microbiologie clinique et des maladies infectieuses (European society of clinical microbiology and infectious diseases) [ESCMID] a été réalisée et dont les taux de résistances calculés sur un effectif de 314 souches étaient estimés pour les antibiotiques suivants [243] :
-Macrolides : 15 à 20 % des souches de Propionibacterium acnes résistent à la
clindamycine (15%), résistances possibles à l’érythromycine (17%) et aux autres macrolides et apparentés liées à des mutations au niveau de l’ARNr 23S ou gène ermX ou à une méthylation au niveau ARNr 23S. Dans cette étude, elle n’a pas été notée de souche résistante au linézolide [242, 243].
-Tétracyclines : 3 % des souches résistantes liées à des mutations ARNr 16S en
Une augmentation importante de la résistance des Propionibacterium acnes aux antibiotiques a été observée lors cette étude [243].
L’évolution des résistances de Propionibacterium acnes aux principaux
antibiotiques est rapportée dans le tableau VI
Tableau VI : Evolution du taux de résistance de Propionibacterium acnes aux macrolides et aux cyclines [247].
Antibiotiques 1976 1978 1996 2003 Résistance aux macrolides 0% 20% 62% 50%
Résistance aux cyclines 0% 20% 62% 20%
Une autre étude épidémiologique réalisée sur 10 années (2002-2011) montre une augmentation significative du nombre des Propionibacterium acnes, et montre un problème de résistance aux antibiotiques [248].
Malgré ce constat de résistance croissante de Propionibacterium acnes aux antibiotiques, il ne semble pas que la communauté dermatologique ait constaté une augmentation des échecs thérapeutiques, par ailleurs, aucune étude valide n’a pu corréler échec clinique et résistance de Propionibacterium acnes aux antibiotiques ; ceux-ci peuvent être expliqués par le fait que la résistance ne modifie pas les qualités anti-inflammatoires de l’antibiotique [247], ainsi, les infections à Propionibacterium acnes sont réfractaires aux problèmes d’antibiorésistance [248].
La présentation des taux de résistances de Propionibacterium acnes aux antibiotiques doit contribuer à établir des recommandations concernant le choix thérapeutiques individuels
Principaux antibiotiques actifs sur Propionibacterium acnes
Propionibacterium acnes est sensible aux β-lactamines tel que la pénicilline G ou
l’amoxicilline (antibiotiques prescrits en première intention), aux tétracyclines, aux macrolides (clindamycine [218], clarithromycine ou azithromycine [249]), au chloramphénicol, à la rifampicine, aux glycopeptides, aux fluoroquinolones [218] (ciprofloxacine et moxifloxacine) [242] et à l’acide fusidique [250]. Ces antibiotiques sont classés selon plusieurs critères, dont les plus importants sont le mécanisme d’action et le spectre d’action [206] (Tableau VII).
Nous insistant sur le fait que les Propionibacterium acnes sont sensibles aux
antiseptiques et aux désinfectants tels que l’hypochlorite de sodium 1%, l’éthanol 70%, le glutaraldéhyde et le formaldéhyde [65].
-Staphylococcus aureus
Les antibiotiques à tester pour les Staphylococcus aureus figurent sur le Tableau VIII.
Tableau VIII : Antibiotiques à tester pour Staphylococcus aureus [241].
Comportement de Staphylococcus aureus vis-à-vis de certains antibiotiques Un prélèvement de pus cutané au niveau des lésions réalisé en 2009, a ramené des
Staphylococcus aureus résistants à l’oxacilline [252] (ou méticilline ou céfoxitine ou
cloxacilline [253]), à la kanamycine, à la tobramycine, à l’érythromycine, à la spiramycine, à la lincomycine, [252] à l’ofloxacine et à la rifampicine, et des staphylococcus aureus