Os produtos e quantidades usadas neste ensaio estão representados na seguinte tabela (Tabela 4):
Tabela 4: Produtos e concentrações testados no ensaio do cometa
Reagentes e Soluções:
Para a realização do ensaio foi indispensável a preparação prévia de algumas soluções e reagentes:
Solução de Ringer para insetos pH=7,2 : NaCl 46 mM; KCl 182 mM; CaCl2 3mM;
Tampão de Lise: 2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 0,77 % N-
Lauroil sarcosinato, 0,25 M NaOH, pH=10. Adicionar TRITON, na concentração de 1% da quantidade de solução de lise. Armazenar a 4 ˚C;
Buffer F: 50 mL de buffer diluído em 450 mL de água destilada; Enzima FPG (Formamidopirimidina-DNA-glicosilase);
Solução de NaOH;
Produto Ensaio com SN
TH 200 µL/L
LM 11,4 g/L
Reagente de EDTA;
PBS: 50 mL de PBS 10x diluído em 450 mL de água destilada;
Tampão de Eletroforese: 75 mL NaOH 10 M, 5 mL de EDTA 0,5 M (etileno diamino
tetra-acético), dH2O até perfazer 2,5 L.
Equipamento e material laboratorial:
Para realizar o ensaio foi necessário verificar a disponibilidade dos equipamentos e material de laboratório. O equipamento e material de laboratório para a realização do ensaio foi o seguinte: Banho Termostatizado; Estufa; Centrifugadora; Eppendorfs; Micropipetas; Pipetas de Pasteur; Lâminas; Lamelas; Pinças; Vareta de vidro
Microscópio Ótico de Fluorescência; Tina de Eletroforese.
Preparação das Lâminas Pré-coating:
A preparação das lâminas é um passo fundamental para se obterem géis estáveis e uniformes, assegurando assim a viabilidade dos mesmos até à conclusão do ensaio. Desta forma, para obter melhores resultados, deve reduzir-se o “background”, pois pode interferir com a visualização dos cometas (Tice et al, 2000).
Esta etapa deve ser efetuada previamente, da seguinte forma:
Dissolver a agarose (ponto de fusão normal) a 1 % em água destilada no micro-ondas; Manter a solução de agarose em banho-maria a 40 ˚C, para evitar a polimerização da mesma;
Submergir as lâminas na agarose (ponto de fusão normal); Retirar e efetuar a limpeza da face oposta da lâmina; Deixar secar à temperatura ambiente na posição horizontal.
Esta etapa é de grande relevância uma vez que a camada de agarose permite que os neuroblastos adiram à mesma.
Obtenção de Células Individualizas – Neuroblastos
Esta etapa é efetuada do seguinte modo:
Com o auxílio de uma pinça proceder à retirada de quatro larvas no terceiro estádio larvar de cada frasco;
Colocar numa lâmina com uma a duas gotas de solução de Ringer e efetuar a dissecação das larvas, com o intuito de obter o cérebro das mesmas (Figura 10);
Colocar os cérebros nos respetivos eppendorf, devidamente identificados, com 20 µL de solução de Ringer, os quais são mantidos em gelo até à execução do próximo passo.
Figura 10: Cérebro de uma Drosophila melanogaster no 3º estádio larvar
Tratamento das amostras:
Macerar os cérebros que se encontram depositados no fundo do tubo, com uma vareta de vidro, permitindo uma separação mais eficaz das células;
Proceder à incorporação das células em agarose;
Adicionar a cada eppendorf 20 μL de agarose (baixo ponto de Fusão) a 2 % e 280 μL de agarose a 1%;
Colocar 70 μL em cada ponta da lâmina, as quais são cobertas com lamelas. Para que a agarose polimerize corretamente, as lâminas são colocadas a 4 ˚C.
Identificar previamente as lâminas de forma a evitar trocas de concentrações; Retirar as lamelas com o máximo de cuidado, para não desfazer o gel;
Colocar as lâminas num coplin com a solução de lise, previamente preparada e armazenar durante uma hora a 4 ˚C.
Preparação das Amostras para a Atuação da Enzima FPG
A enzima FPG vai ser a responsável pela identificação das quebras simples no DNA, nos locais onde há purinas alteradas, reconhecendo especificamente a 8-oxoguaninas (Tice et
al, 2000).
Retirar do tampão de lise as lâminas, e fazer 3 lavagens de 5 minutos com Buffer F, a 4 ºC;
Diluir previamente 10 μL de enzima em 200 μL de Buffer F;
Adicionar 40 μL de enzima FPG diluída em cada gel, e cobrir os mesmos com lamelas;
Colocar as lâminas numa estufa a 37 °C; Deixar atuar a enzima durante 30 minutos;
Retirar as lâminas da estufa ao fim deste período, bem como as lamelas dos géis.
Apenas os duplicados das amostras passam por este tratamento com a finalidade de identificar purinas oxidadas, evidenciando o nível de danos oxidativos nas bases das células danificadas.
Tratamento alcalino
Colocar as lâminas na tina de eletroforese;
Encher a tina com solução de eletroforese recém-preparada de modo a ultrapassar o nível das lâminas.
O tempo de exposição das lâminas a esta solução foi de 20 minutos, a 4 °C e em condições de obscuridade. O tratamento alcalino (pH> 13) permite a desnaturação do DNA e a conversão dos locais apurinicos/apirimidinicos em quebras de cadeia.
Eletroforese
Colocar as lâminas na tina de eletroforese que contém o tampão de eletroforese; Aguardar cerca de 10 minutos;
Ligar a tina a um conversor configurado com 25 V, 300 mA, por um período de 30 minutos.
O ajuste dos valores consegue-se modificando o volume do tampão na tina, isto é, um maior volume corresponde a uma maior resistência e consequentemente maior amperagem.
Neutralização (Lavagem das lâminas)
Retirar as lâminas da tina eletroforética; Colocar em tinas coplins;
Adicionar Tampão fosfato-salino (PBS) uma vez; Deixar atuar durante 10 minutos, a 4 ºC;
Retirar o PBS e efetuar uma lavagem com água destilada durante o mesmo período de tempo e nas mesmas condições;
Retirar as lâminas e deixar a secar à temperatura ambiente.
Coloração
Colocar sobre o gel 20 µL de DAPI (4,6- diamino-2-fenilindol) (1 µg/mL); Cobrir o gel com uma lamela com dimensões de 22x22mm.
As lâminas devem ser armazenadas, até à sua visualização, num local escuro, de forma
Visualização ao Microscópio de Fluorescência
A visualização das lâminas efetuou-se com o recurso a um microscópio de fluorescência, equipado com uma lâmpada fluorescência de 100 W e um filtro de excitação apropriado para a coloração DAPI. Observaram-se visualmente 50 cometas em cada gel, totalizando 100 cometas por lâmina. Os cometas foram classificados de acordo com o referido anteriormente no ponto 1.3.1.1. A análise foi efetuada com o recurso ao programa informático
Visual Comet Assay.
Análise Estatística:
A análise e a significância estatística foram determinadas com o recurso ao teste
ANOVA, disponibilizado no programa GraphPad Prism® 6.