1.1 L'origine de la contamination
A n de bien comprendre le phénomène de contamination observé dans GHS, il est essentiel de se pencher plus en détail sur la composition des échantillons à partir desquels est extrait l'ARN. Dans ce but, nous décrivons d'abord les diérents types cellulaires présents dans le sang, avant de détailler les méthodes de puri cation cellulaire utilisées pour l'isolation des monocytes.
1.1.1 Composition du sang
Le sang est composé d'éléments cellulaires ottant dans un milieu liquide appelé plasma et composé d'eau, de solutés minéraux (O2, CO2, divers ions,. . .), de nutriments (lipides, acides aminés, glucides) et de protéines en suspension (albumine, brinogène, cho-lestérol, . . .). Les élements cellulaires contenus dans le sang sont générés par le processus de l'hématopoïèse présenté dans la gure 10.1. Parmi ces éléments on trouve :
des globules rouges (ou érythrocytes), cellules sans noyau responsables du trans-port de l'oxygène. On compte entre 4 et 5 millions de globules rouges par ml de sang.
des plaquettes (ou thrombocytes), également sans noyau et impliquées dans le processus de coagulation et de réparation de la paroi artérielle. On compte près de 400 000plaquettes par ml de sang.
des globules blancs (ou leucocytes) assurant la réponse immunitaire contre les agents pathogènes. On dénombre entre 5000 et 7000 globules blancs par ml de sang parmi lesquels on trouve :
50 à 75% de granulocytes. Ces cellules polynucléaires sont impliquées dans la réponse immunitaire non spéci que et participent à diriger celle-ci par l'exocytose de granules contenant des agents pro-in ammatoires (comme l'histamine) ou anti-in ammatoires.
20 à 40% de lymphocytes répartis entre les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules tueuses (Natural Killer Cells an anglais). Les lymphocytes sont impliqués dans la réponse immunitaire spéci que (lymphocytes T et B) et non spéci que (cellules tueuses et certains lymphocytes T), et agissent soit par pré-sentation d'antigènes cytotoxiques conduisant à l'apoptose2 des cellules infectées (lymphocytes T et cellules tueuses), soit par la libération d'anticorps (lympho-cytes B) qui se xent sur les antigènes et participent à la réponse immunitaire.
1. LA CONTAMINATION DANS L'ÉTUDE GHS
Figure 10.1 L'hématopoïèse.
3 à 8% de monocytes, qui sont des cellules immunitaires et in ammatoires dont le rôle est détaillé dans le chapitre 2 (section 2.2). C'est le type cellulaire ciblé dans les études GHS et Cardiogenics.
Lorsque nous nous intéressons aux monocytes circulants comme c'est le cas dans GHS, il est donc nécessaire de séparer les diérents types cellulaires présents dans le sang par des méthodes de puri cation. Lorsque cette séparation ne se fait pas parfaitement, les échantillons peuvent donc se trouver contaminés par des types cellulaires sanguins non désirés.
1.1.2 Méthodes de puri cation cellulaire
L'isolation d'un type cellulaire se fait généralement en deux étapes :
Dans un premier temps on introduit dans les échantillons de sang complet un réactif nommé Ficol. Ce réactif permet de séparer les diérents composants du sang en fonction de leur densité, lors de la centrifugation. Le sang se décompose alors en 4 phases distinctes
le plasma et les plaquettes,
le buy coat qui contient les cellules mononucléaires (lymphocytes et mono-cytes),
le Ficol,
les granulocytes et globules rouges qui sont piégés par le Ficol.
On eectue ensuite une puri cation (ou tri cellulaire) des cellules mononucléaires contenues dans le buy coat. Cette puri cation peut se faire selon deux techniques illustrées par la gure 10.2 :
CHAPITRE 10. DÉCONVOLUTION DE SIGNAUX DANS UN MÉLANGE DE TYPES CELLULAIRES
Figure 10.2 Principe simpli é du tri cellulaire par sélection positive et néga-tive (Source : The Scientist [108]).
des anticorps spéci ques des marqueurs membranaires spéci ques des cellules ci-blées (dans le cas des monocytes on utilise des anticorps spéci ques du marqueur CD14). Les cellules présentant le marqueur membranaire ciblé sont ensuite ex-traites à l'aide d'un électro-aimant. L'inconvénient de cette méthode est que la liaison des marquers membranaires aux billes magnétique peut activer des voies de signalisation et par conséquent modi er le transcriptome de la cellule ciblée. Dans la sélection négative, on utilise des marqueurs ciblant les principaux types
cellulaires présents à savoir des lymphocytes T (CD2, CD3, CD8), B (CD19) et NK (CD2, CD8, CD56), ainsi que des marqueurs spéci ques des globules rouges (Glycophorin A) et des granulocytes (CD66b). On retire ensuite les types cellu-laires ciblés à l'aide d'un électro-aimant comme lors d'une sélection positive. Les résidus présents dans la solution après extraction des types cellulaires non dési-rés forment alors une solution enrichie en monocytes, mais dans laquelle peuvent néanmoins rester des traces des autres types cellulaires.
Le choix d'une de ces deux méthodes est un choix souvent discuté dans la littérature [109,110] et pour lequel il n'existe pas de consensus à ce jour. Dans GHS, c'est l'approche par sélection négative qui a été choisie a n d'éviter l'activation des monocytes par la liaison d'anticorps sur leurs marqueurs membranaires. Des contrôles préliminaires ont montré que les monocytes représentaient entre 94% et 99% des cellules présentes dans la solution enrichie, suggérant un bon fonctionnement de la méthode de tri utilisée, le reste étant principalement des plaquettes. Malgré cela, comme nous le verrons dans les
2. LA CONTAMINATION DANS L'ÉTUDE GHS
sections suivantes, l'analyse du transcriptome suggère une réalité assez diérente et montre clairement que la présence de contaminants, même dans des proportions in mes, peut fortement in uencer les résultats des analyses d'association3. Bien que le phénomène de contamination semble moins important dans des données sélectionnées par tri positif (en particulier la contamination par les plaquettes), ce phénomène ne peut pas être exclu comme nous le verrons plus loin.
1.2 Impact de la contamination
Dans la suite nous considérons les données d'expression comme provenant d'un mé-lange de plusieurs types cellulaires sanguins présents en des quantités variables d'un échan-tillon à l'autre. On note qkj la quantité du ketype cellulaire chez le jeindividu, avec q1· le type cellulaire majoritaire (ici les monocytes). Soit une variable d'intérêt notée z dont on souhaite tester l'association avec les expressions (par exemple un SNP). La contamination peut biaiser les résultats par deux mécanismes diérents (et non exclusifs) :
1. La variable z in uence la proportion des diérents types cellulaires présents dans le mélange : si un transcrit a des niveaux d'expression diérents selon le type cel-lulaire, la variation des proportions due à la variable z induit une association entre l'expression du transcrit et la variable z. Dans ce cas les proportions des diérents types cellulaires estimés agissent comme des facteurs confondants et leur eet peut être retiré par un ajustement simple sur les proportions du mélange (qk·)k>1. 2. La variable z in uence le niveau du transcrit dans un type cellulaire autre que le type
majoritaire : l'eet de la variable z sur l'expression peut être observé dans le mélange si le type cellulaire aecté par cette variable est présent en quantité su sante. Dans ce cas, si z aecte le type cellulaire k, on s'attend à observer un eet de z d'autant plus fort que le type cellulaire k est présent en grande quantité dans le mélange, ce qui se traduira par une interaction entre la quantité du type cellulaire k et la variable étudiée z. Ainsi l'ajout dans le modèle de régression, des termes d'interactions entre z et les proportions du mélange (qk·)k>1 permet de contrôler pour un éventuel eet de z dans les types cellulaires contaminants, voire de déterminer les types cellulaires dans lesquels le niveau d'expression du transcrit est aecté par la variable z. Cette approche rejoint celle proposée par Shen-Orr et al. [111] qui consiste à tirer parti de comptes cellulaires réalisés par cytométrie de ux pour identi er la provenance des signaux d'association dans un mélange de types cellulaires.
CHAPITRE 10. DÉCONVOLUTION DE SIGNAUX DANS UN MÉLANGE DE TYPES CELLULAIRES