2 GHS et Cardiogenics : Deux projets d'étude du trans- trans-criptome à grande échelle

La majeure partie des travaux réalisés dans le cadre de cette thèse l'ont été à partir des données issues de la Gutenberg Heart Study et ont été répliqués grâce au données du projet européen Cardiogenics que nous présentons dans cette section.

2.1 Objectif et caractéristiques des études

L'étude GHS initiée en 2006 par Stefan Blankenberg est un projet collaboratif entre le départment de cardiologie de l'université Johannes-Gutenberg située à Mainz (Allemagne) et l'INSERM. L'objectif principal de cette étude est d'identier de nouveaux facteurs de risques (génétiques, plasmatiques, environnementaux, psychosociaux) associés à l'athéro-sclérose et ses phénotypes intermédiaires en population générale. Dans ce but, une cohorte de plus de 3300 sujets a été recrutée dans la population générale des habitants de la ré-gion de Mainz. Seuls les sujets âgés de 35 à 75 ans ont été inclus et une stratication a été eectuée lors de l'échantillonnage an d'avoir un nombre de sujets comparables pour chaque sexe et chaque tranche d'age. Ces sujets ont subi un examen médical très poussé comprenant un large panel de phénotypes cardiovasculaires (échographie cardiaque et vasculaire, fonction endothéliale, . . .). Cette étude dispose également d'importantes res-sources biologiques (ADN, ARN, Plasma, Serum, . . .). Tous les individus de l'étude ont été génotypés à l'aide de la puce génome entier Aymetrix 6.0. De plus, pour la moitié des sujets, l'ARN a été extrait le jour du prélèvement à partir de monocytes fraichement isolés par sélection négative et le transcriptome a été mesuré à l'aide de la puce Illumina

CHAPITRE 2. LE TRANSCRIPTOME EN ÉPIDÉMIOLOGIE CARDIOVASCULAIRE

HT-12 v2. Les investigations cliniques et biologiques ont été conduites à Mainz, les ana-lyses statistiques sont réparties entre Lübeck et Paris. Dans le cadre de cette thèse, j'ai été en charge du contrôle qualité et de l'analyse des données d'expression de l'étude GHS. Seuls les individus d'origine européenne ont été inclus dans les analyses. Le détail des étapes de normalisation et de contrôle qualité réalisées sur ces données est décrit dans les chapitres 4 et 5.

2.1.2 Cardiogenics

L'étude Cardiogenics est un projet européen nancé par le FP6, regroupant 15 par-tenaires européens dont le but est la caratérisation de nouveaux gènes et mécanismes de prédisposition à la maladie coronaire. Comme GHS, l'étude Cardiogenics intègre à la fois des données d'expression provenant de monocytes (et de macrophages), et des données génotypiques pan-génomiques. L'étude Cardiogenics comporte deux échantillons de cas et de témoins. Le premier groupe inclue 363 cas de syndrôme coronaire aigu ainsi que déni par la Société Européenne de Cardiologie. Ces cas, âgés de 26 à 87 ans ont été re-crutés parmi les cas incidents des hôpitaux de Leicester, Lübeck, Paris et Regensburg. Le deuxième groupe comprend 395 témoins recrutés parmi des donneurs de sang volontaires à Cambridge et appariés par age aux cas. Du fait de la plus forte prévalence des mala-dies coronaires chez les hommes, d'importantes diérences existent entre les proportions d'hommes et de femmes observées chez les cas et les témoins (12% de femmes chez les cas contre 59% chez les témoins). Les individus ont été génotypés à l'aide de puces Illumina Sentrix Human Custom 1.2M et Human 610 quad. L'isolation des monocytes par sélection positive a ensuite été faite séparément dans chaque centre et l'extraction d'ARN a été eectué à partir des monocytes immédiatement après isolation. Les ARN ont ensuite été analysés dans l'U937 à l'aide de puces d'expression Illumina Ref8 v3. Tous les individus inclus dans les analyses sont d'origine européenne. Les étapes standard de normalisation et de contrôle qualité ont été réalisées3 sur ces échantillons. Dans le carde de ma thèse, j'ai utilisé ces données principalement pour la réplication des résultats obtenus dans GHS.

2.2 Le choix des monocytes

Comme nous venons de le voir, les études GHS et Cardiogenics comportent toutes les deux un volet transcriptomique s'appuyant sur l'étude des ARN monocytaires. Ce choix est lié au rôle prépondérant joué par le monocyte dans l'athérosclérose et au caractère ubiquitaire des fonctions remplies par le monocyte qui en fait un modèle cellulaire perti-nent pour l'étude d'un grand nombre de pathologies présentant une composante immuno-inammatoire. En eet, les monocytes sont des cellules centrales du système immunitaire,

3. GHS ET CARDIOGENICS : ÉTUDE DU TRANSCRIPTOME À GRANDE ÉCHELLE

capables de :

 reconnaitre les antigènes à la surface des cellules avoisinantes (ou des anticorps liés à un agent pathogène), assurant ainsi la reconnaissance du non soi et la spécicité de la réaction immunitaire ;

 phagocyter an de détruire les corps étrangers en les absorbant au travers de la membrane cellulaire ;

 présenter à sa surface des antigènes du non soi issus des cellules lysées an de diriger plus ecacement la réponse immunitaire ;

 induire la mort cellulaire programmée (ou apoptose) de cellules avoisinantes par présentation d'anticorps cytotoxiques.

D'autre part, les monocytes jouent un rôle prépondérant dans l'inammation par la syn-thèse de nombreuses cytokines pro ou anti-inammatoires. Ils jouent également un rôle important dans l'athérosclérose via leur capacité à se diérencier en cellules dentritiques (spécialisées dans l'adaptation de la réponse immunitaire) et en macrophages (spécialisés dans la réponse immunitaire non spécique) qui sont des acteurs majeurs de la formation de la plaque d'athérome.

Ainsi, les monocytes constituent un modèle idéal pour l'étude de l'athérosclérose et des maladies inammatoires. A noter qu'ils sont en outre facilement accessibles par un simple prélèvement sanguin. A l'issue du prélèvement, les monocytes naturellement présents dans le sang peuvent être isolés des autres types cellulaires sanguins par ltrage. Deux types de ltrage existent :

 Le ltrage positif consiste à isoler les monocytes en les xant à des anticorps recon-naissant un marqueur cellulaire spécique des monocytes (généralement la protéine CD14). Ce type de ltrage présente une très forte spécicité mais a l'inconvénient de modier légèrement le transcriptome des monocytes par l'activation de la voie de signalisation associée à ce marqueur.

 Le ltrage négatif consiste à isoler les monocytes par retrait successif des divers types cellulaires présents dans l'échantillon sanguin (plaquettes, globules rouges, lymphocytes T et B, granulocytes,. . .). Si elle permet d'isoler des monocytes au repos (sans activation de la voie CD14), cette méthode ne permet pas d'assurer une pureté totale des échantillons de monocytes du fait de la contamination par d'autres types cellulaires résiduels. Cette contamination peut entrainer des biais dans l'étude du transcriptome dont il faut tenir compte (cf. chapitre 10).

Dans un cas comme dans l'autre, les monocytes étudiés doivent être vus comme un modèle able permettant de s'approcher au mieux du fonctionnement des monocytes recrutés dans la plaque d'athérome. Il serait en revanche illusoire de prétendre à une mesure dèle en tout point de la réalité des modications transcriptomiques présentes dans la plaque.

CHAPITRE 2. LE TRANSCRIPTOME EN ÉPIDÉMIOLOGIE CARDIOVASCULAIRE