Sept systèmes (ou modèles) de LlFpg ont été créés pour réaliser des simulations de dynamique moléculaire classique et ainsi mieux comprendre les mécanismes fonctionnels impliquant cette boucle, ils sont résumés dans le Tableau 13 ci-après :
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Tableau 13 : Description des 7 systèmes créés pour l’étude de la boucle LCL de LlFpg
Nom du
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*La production du système Fpg ADN THF 8-oxoG libre boucle fermée s’arrête à ~35,0 ns après une dégénérescence du complexe ADN/protéine à ~25,0 ns, les détails sont dans la partie analyse.
Le FaPyG et la 8-oxoG libre ont été modélisés à partir des cFaPyG et 8-oxoG des structures 1XC8 et 1R2Y (Figure 63). Pour obtenir la structure du FaPyG, nous avons remplacé le C4’ de la fonction carba par un O4’ et ainsi obtenir un sucre classique désoxyribose. La 8-oxoG libre est obtenue en copiant uniquement les coordonnées des atomes du nucléotide de la 8-oxoG de la structure 1R2Y.
Certains de ces systèmes comportent des molécules non répertoriées dans les champs de force d’AMBER, et notamment les molécules FaPyG, THF, 8-oxoG libre, l’aa P1 neutre et l’atome de zinc. Les paramètres du FaPyG en position extra-hélicale [267] et de la P1 neutre en position N-terminale [211]
sont extraits de la littérature. Les paramètres des charges et de géométrie de la 8-oxoG libre et du Zn2+
ont été générés par le logiciel de calculs quantiques Antechamber [268] et Gaussian [269] dans le cadre de notre collaboration avec l’ICOA. Ces paramètres ne seront pas présentés dans ce manuscrit car ils n’ont pas encore fait l’objet d’une publication. La lésion FaPyG est considérée comme un substrat, car il s’agit d’une base endommagée encore reliée à l’ADN, et la 8-oxoG libre est considérée comme un produit d’excision car il s’agit d’une base endommagée coupée.
180 Figure 63 : Structures du FaPyG et de la 8-oxoG
Les structures sont issues de 1XC8 [196] et 1R2Y [183], respectivement. Ces molécules ont été utilisées pour construire les systèmes Fpg ADN FaPyG boucle fermée (1XC8), Fpg ADN FaPyG (1XC8) boucle relâchée (1PM5), Fpg ADN THF (1PM5) boucle fermée (1XC8) 8-oxoG libre (1R2Y) et Fpg ADN THF boucle relâchée (1PM5) 8-oxoG libre (1R2Y). Pour obtenir un FaPyG, nous avons modifié le C4’ en O4’
de la structure du cFaPyG de 1XC8 (flèche rouge). Quant à la 8-oxoG libre, nous avons simplement copié les coordonnées de la base azotée 8-oxoG sans prendre le sucre et le groupement phosphate qui y était relié.
Il convient de noter que le système que l’on désire étudier est LlFpg car c’est la protéine la mieux maîtrisée par les biochimistes de l’équipe, ainsi, les modèles de la protéine reconstruits sont basés exclusivement sur des structures de cette enzyme. Les structures cristallographiques initiales utilisées pour construire les modèles correspondent aux PDBids 1PM5, 1XC8 et 1R2Y. Il s’agit de structures des protéines LlFpg (1PM5, 1XC8) et BstFpg (1R2Y). Les structures 1PM5 et 1XC8 ont servi de bases à la conception des sept systèmes car elles contiennent les coordonnées 3D de la protéine LlFpg complexée à un ADN THF (analogue de site abasique) ou à un ADN FaPyG respectivement. Ces deux structures possèdent chacune un état différent de la boucle LCL, relâchée (1PM5) et fermée (1XC8) (Tableau 13 et Figure 62). La structure 1R2Y est une BstFpg qui est un organisme thermophile, elle contient une structure de la protéine entièrement résolue et complexée à un ADN 8-oxoG en position extra-hélicale dans le site actif de l’enzyme avec une orientation anti. Cette position de la 8-oxoG est compatible avec un état fermé de la boucle LCL de LlFpg, c’est-à-dire que la boucle LCL de 1XC8 recouvre parfaitement la 8-oxoG de 1R2Y, sans engendrer de clash stérique (Figure 64 B). Nous aurions pu utiliser les coordonnées de la c8-oxoG de la structure 4CIS, cependant, comme mentionné précédemment, une partie de la boucle LCL dans cette structure n’est pas résolue, et la base en position extra-hélicale dans le site actif possède une orientation intermédiaire entre syn et anti qui, superposée avec la boucle fermée de 1XC8, est légèrement décalée avec la boucle LCL qui ne couvre
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pas le dommage (Figure 64 A). Nous avons donc écarté la structure 4CIS pour la construction des systèmes.
Dans les modèles comportant une 8-oxoG libre, nous avons appliqué une contrainte de distance de 4 Å entre le C1’ du THF et le N de la P1 afin de mimer une base de Schiff. Cela est justifié par le fait que c’est le complexe qui se forme après l’excision de la base endommagée par l’enzyme et le fait que le site actif contient un produit d’excision et non plus un substrat dans ces modèles [217].
Comme décrit dans l’introduction, la base de Schiff est une liaison covalente entre le C1’ de la base excisée et le N de la P1 de l’enzyme. Une liaison covalente entre ces deux atomes engendre une distance de ~1,5 Å, nous avons cependant choisi une contrainte de distance de 4 Å car c’est la valeur de la distance entre ces deux atomes dans la structure de 1PM5 et que nous souhaitons ne pas induire
de clash stérique dans nos modèles.
Figure 64 : Boucle LCL dans les structures de LlFpg et de BstFpg
A) Superposition des structures de LlFpg 1XC8 [201] et 4CIS [202]. La protéine est représentée en cartoon blanc, la boucle LCL de 1XC8 est représentée en rouge et la boucle partiellement résolue en cristallographie de 4CIS est en bleu. Le c8-oxoG issue de la structure de 4CIS est représenté en bâtonnets. L’ADN est représenté en cartoon noir. Cette représentation montre que l’orientation intermédiaire syn/anti de la c8-oxoG issue de 4CIS est légèrement décalée par rapport à la boucle LCL fermée de 1XC8. B) Superposition des structures de LlFpg 1XC8 [201] et de BstFpg 1R2Y [183]. La protéine est représentée en cartoon blanc, la boucle LCL de 1XC8 est représentée en rouge et de 1R2Y en bleu. Le 8-oxoG issue de la structure de 1R2Y est représenté en bâtonnets. L’ADN est représenté en cartoon noir. Dans cette représentation on remarque que la boucle LCL de 1XC8 recouvre totalement la 8-oxoG issue de la structure 1R2Y.
Les nouveaux modèles 3D ont été créés par l’assemblage des coordonnées 3D des atomes désirés issues de structures cristallographiques obtenues de la PDB. Les éléments non résolus (chaines
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latérales et aa entiers) dans les structures cristallographiques (notamment les aa 221-224 de 1PM5 et la chaine latérale de R220 de 1XC8) ont été reconstruits avec le module xLeap d’AMBER et grâce au champ de force d’AMBER ff12SB. Les systèmes sont solvatés, neutralisés, minimisés, thermalisés et équilibrés selon la procédure décrite dans la section III.1.4 p. 136 de la partie méthode. Les systèmes sont ensuite produits en DM sur des durées allant de 40 à 200 ns avec un pas d’intégration de 2 fs et en utilisant l’algorithme SHAKE pour contraindre la vibration des liaisons R-H. Les modèles sont dans des conditions de pression et de température constante (NPT) ainsi que dans des conditions périodiques dans lesquelles les interactions électrostatiques sont modélisées par l’algorithme Particle Mesh Ewald (PME).