Compléter à 1 litre avec de l‘eau distillée [191]. Venin de vipère de Russell

1- Ajouter 2 ml d‘eau distillée à 0,2 mg de venin pour obtenir 0,1 mg/ml. 2- Congeler à -35 °C ou à une température inférieure, en aliquotes de 20 μl.

3- Pour l‘utilisation, décongeler et diluer à approximativement 1 partie pour 500 dans du tampon imidazole (10 μl dans 5 ml) pour obtenir du venin de vipère de Russell dilué (DRVV) [191].

Phospholipides.

Reconstituer avec de l‘eau distillée conformément aux directives du fabricant [191]. Solution de chlorure de calcium 25mM

Plaquettes lavées lysées par congélation-décongélation

Des plaquettes humaines normales sont lavées et lysées par congélation-décongélation pour exposer les phospholipides procoagulants [191].

Plasma normal poolé

Ce plasma doit être préparé soigneusement afin de s‘assurer qu‘un nombre minimal de plaquettes résiduelles soient présentes, comme décrit dans la préparation de l‘échantillon ci-dessus. Il peut être pratique d‘utiliser le plasma normal poolé décrit, pourvu que le plasma poolé soit centrifugé à deux reprises avant d‘être congelé [191].

 Méthode

1- Dans un tube à essai en verre préchauffé à 37 °C, ajouter 0,1 ml de phospholipides et 0,1 ml de plasma normal poolé.

2- Chauffer à 37 °C pendant 1 à 2 minutes.

3- Ajouter 0,1 ml de RVV dilué (RVV à la température ambiante). Mélanger et laisser incuber pendant exactement 30 secondes à 37 °C.

4- Ajouter 0,1 ml de chlorure de calcium 25 mM préchauffé. Mélanger et démarrer le chronomètre.

5- Chronométrer la formation du caillot. Effectuer tous les tests en double.

Le plasma normal poolé devrait avoir un temps de coagulation entre 30 et 35 secondes. Si <30 secondes, diluer davantage la solution de RVV en ajoutant plus de tampon imidazole.

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Si >35 secondes, ajouter plus de la solution stock de RVV. Répéter le test sur du plasma normal poolé jusqu‘à l‘obtention d‘un temps entre 30 et 35 secondes.

6- Préparer une dilution de 1/8 de PL dans du NaCl 0.9%; par exemple, en ajoutant 0,1 ml de PL à 0,7 ml de NaCl.

7- Répéter les étapes 1 à 5 en remplaçant les PL non dilués par la dilution de PL préparée ci-dessus.

Si le temps de coagulation (précédemment de 30 à 35 secondes) est désormais prolongé à 35 - 40 secondes cela indique que la concentration en PL est suffisamment basse pour rendre le test sensible aux anticorps phospholipides.

Si le temps de coagulation dépasse 40 secondes, répéter les étapes 1 à 5 en utilisant du PL dilué 1/4. Si le temps de coagulation demeure entre 30 et 35 secondes, répéter les étapes 1 à 5 en utilisant du PL dilué 1/16. Si le temps est entre 35 et 40 secondes, passer à l‘étape suivante. 8- Avec de cette solution de RVV (qui donne un temps de coagulation entre 30 et 35 secondes avec du PL pur et du plasma normal poolé) et la dilution de phospholipide qui donne un temps de coagulation de 35-40 secondes, répéter les étapes 1 à 5, en substituant le plasma normal poolé par le plasma du patient.

9- Calculer le rapport des temps de DRVV (DRVVT) : diviser le temps du patient par celui au DRVVT obtenu avec le plasma normal poolé (rapport de DRVVT).

10- Les étapes 1 à 5 sont maintenant répétées en utilisant le plasma normal poolé, et le plasma à tester, en substituant les PL par des plaquettes lavées et lysées par congélation-décongélation. Cette procédure est nommée procédure de neutralisation plaquettaire (PNP).

À l‘étape 2, le mélange est incubé pendant 10 minutes. Le rapport du temps du plasma à tester divisé par le temps du plasma normal poolé est calculé pour la PNP [191].

Préparation des plaquettes lavées pour le DRVVT

 Réactif

Tampon de Tyrode pH 6,5

 8,0 g NaCl

60  0,065 g NaH2PO42H2O

 0,415 g MgCl2 6H2O

 1,0 g NaHCO3

Dissoudre dans 900 ml d‘eau distillée et ajuster le pH à 6,5. Compléter à 1 litre avec de l‘eau distillée [191].

 Méthode

1- Préparer le plasma riche en plaquettes (PRP) à partir de sang frais citraté en le centrifugeant à 170 g (1200 t/m) pendant 10 minutes à la température ambiante. Ou utiliser des concentrés de plaquettes utilisés pour le traitement de patients.

2- Diluer le PRP 1/2 dans du tampon de Tyrode.

3- Placer les plaquettes diluées dans des tubes à centrifuger à fond conique et centrifuger pendant 10 minutes à 850 g à température ambiante.

4- Enlever le surnageant en utilisant une pipette Pasteur en plastique et resuspendre le culot de plaquettes dans du tampon de Tyrode (ajouter une quantité de tampon équivalant au volume initial de PRP). Centrifuger à 850 g, comme précédemment. Ce processus est répété deux fois.

5- Enlever le surnageant et resuspendre le culot dans du tampon de Tyrode, en utilisant une quantité de tampon équivalant à 25 % du volume initial de PRP.

6- Aliquoter les plaquettes lavées finales en quantités de 1,0 ml dans des tubes en plastique et les congeler-décongeler à deux reprises à -20 °C avant de les utiliser

[191].

NB : Recherche de LA sous héparine non fractionnée :

Certains réactifs commerciaux pour le dRVVT ou le TCA contiennent un inhibiteur de l‘héparine (polybrène ou héparinase) jusque 0,6 à 0,8 U/mL (vérifier la normalité du temps de thrombine) [154].

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C. Temps de thromboplastine dilué (TTD)

Le temps de Quick doit être réalisé notamment pour vérifier que le malade n‘est pas sous anti-vitamines K. Il est recommandé de ne pas faire de recherche de LA tant que l‘INR est supérieur à 1,5 [28].

Le temps de Quick qui est réalisé en excès de thromboplastine tissulaire est rarement perturbé par la présence d‘anticoagulants circulants lupiques [64].

Le TTD est un temps de Quick sensibilisé aux LA par réduction de la concentration de thromboplastine [64, 183] (avec une thromboplastine très diluée (habituellement au 1/500e))

[64].

La présence d‘un anticoagulant circulant lupique peut être détectée par un allongement du TTD [64]. Cette technique est néanmoins peu spécifique car le TTD peut être allongé devant toute diminution de l‘un des facteurs explorés par le temps de Quick (VII, X, V, II).

Le TTD peut être également allongé en cas d‘hyperfibrinogénémie (syndrome inflammatoire) ou en présence d‘anticorps anti-VIII de titre élevé. Il faut bien garder en mémoire que le TTD est également perturbé en présence d‘héparine [64].