Comparaison immunohistochimique de cancers non sélectionnés et immunosélectionnés

Pour étayer davantage la conclusion selon laquelle l'immunodéficience est compatible avec la survie des cellules cancéreuses hyperploïdes présentant un stress du RE, nous avons dissocié les tumeurs s’étant développées après l'inoculation des lignées progresseurs ou régresseurs dans les souris wild type, Rag2^−/− ou Rag2^−/−γc−/−

, cultivé les cellules pendant une semaine (pour éliminer les cellules stromales) et ensuite effectué des analyses cytofluorométriques pour déterminer leur contenu en ADN. Cette procédure a révélé que les tumeurs progresseurs présentaient toujours une ploïdie inférieure aux tumeurs régresseurs, les lignées cellulaires régresseurs ont conservé leur phénotype hyperploïde après passage in vivo à travers les 2 souches de souris immunodéficientes, ce qui suggère qu’il n’y a pas eu d’immunosélection des cellules hyperploïdes par le système immunitaire inné (Figure 21A).

Figure 21. Analyse morphométrique de la ploïdie et de la phosphorylation de eIF2α sur des coupes de tissus tumoraux. Les tumeurs progresseurs et régresseurs récupérées à partir des souris C57BL/6, Rag2^−/− ou Rag2^−/−γc

−/−

ont été cultivées in vitro et leur ploïdie a été déterminée par cytofluorométrie A. En parallèle, des coupes histologiques ont été marquées par immunohistochimie pour la détection de la phosphorylation de eIF2α B-E. Barre d'échelle, 20 µm. Des images représentatives sont présentées en (B) L'analyse morphométrique a été effectuée avec l'algorithme développé dans R sur des d'images segmentées des coupes tumorales (C), afin de quantifier l’aire nucléaire (D) et la phosphorylation de eIF2α (E) Les résultats sont représentatifs de 97 tumeurs récupérées. B P -e IF 2 α p e ro xi d a se C P -e IF 2 α p e ro xi d a se D 0 2 4 6 8 10 F re q u e n cy (x1 0 -3) E 0 10 20 30 40 50 60

P- eIF2α intensity (A.U.)

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 F re q u e n cy (x1 0 -3) A Rag2-/-g_c -/-C57BL/6 Progressor (P) C o u n ts 100 101 102 103 2n 4n8n Rag2 -/-2n 4n8n Progressor (P) Regressor (R) 2n 4n 8n Rag2 -/-2n 4n8n Progressor (P) Regressor (R) 2n 4n 8n Rag2-/-g_c -/-C57BL/6 P Rag2 -/-P Rag2 -/-R Rag2-/-g_c -/-P Rag2-/-g_c -/-R C57BL/6 P Rag2 -/-P Rag2 -/-R Rag2-/-g_c -/-P Rag2-/-g_c -/-R C57BL/6 P Rag2 -/-P Rag2 -/-R Rag2-/-g_c -/-P Rag2-/-g_c -/-R C57BL/6 P Rag2 -/-P Rag2 -/-R Rag2-/-g_c -/-P Rag2-/-g_c -/-R 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 Nuclear Area (x10 µm2)

Après excision, les tumeurs ont été également incluses dans la paraffine et traitées plus tard pour la détection immunohistochimique des noyaux (contre-marqués en bleu à l'hématoxyline de Mayer) et de la phosphorylation de eIF2α (révélée par la peroxydase et le pigment brun 3,3'-diaminobenzidine). En utilisant l’algorithme d’analyse morphométrique que nous avons développé (voir Matériels et Méthodes), les scans microscopiques correspondants (Figure

21B) ont pu être segmentés correctement pour détecter les contours nucléaires (Figure 21C),

suivi par le calcul de l’aire nucléaire (Figure 21D) et la quantification de l'intensité de la phosphorylation périnucléaire de eIF2α (Figure 21E). Les résultats obtenus sur l’aire des noyaux ont confirmé ceux obtenus (Figure 20A) par cytométrie en flux (Figure 20A), avec une aire nucléaire plus élevée chez les régresseurs dans les deux souches de souris immunodéficientes.

L’analyse morphométrique de l’intensité de la phosphorylation de eIF2α montre, en, accord avec les résultats obtenus sur l’aire des noyaux, que les tumeurs progresseurs présentent une phosphorylation de eIF2α inférieure à celle des tumeurs régresseurs. De plus, l’hyperphosphorylation de eIF2α des tumeurs régresseurs après passage dans les 2 souches de souris immunodéficientes reste plus élevée, suggérant qu’il n’y a pas eu d’immunosélection des cellules positives pour le stress du RE par le système immunitaire inné.

Tous ces résultats indiquent que la méthode que nous avons développée pour l'analyse morphométrique de la ploïdie et du stress du RE peut être appliquée à des coupes de tissus tumoraux. Cette méthode révèle que les cellules hyperploïdes, présentant un stress du RE ne peuvent persister que dans un contexte immunodéficient.

Ces travaux ont fait l’objet d’une publication dans Oncotarget (Bloy, Sauvat et al. 2015).

DISCUSSION

Nous avons examiné les possibilités selon lesquelles la polyploïdie (un phénomène cellulaire qui augmentent l'immunogénicité des cellules tumorales) pouvait augmenter l'antigénicité des cellules tumorales par un effet sur l'immunopeptidome restreint au CMH de classe I. Grâce à des méthodes sophistiquées de spectrométrie de masse nous avons identifié des peptides associés au CMH de classe I spécifiquement présentés à la surface des cellules de lymphome qui avaient été polyploidisées in vitro. Ces peptides ayant de plus persisté sur de telles cellules lors de leur passage dans des souris immunodéficientes, mais ayant disparu lors de

l'immunosélection de ces cellules dans des hôtes immunocompétents. Bien que la plupart de ces peptides soient immunogènes ex vivo, ayant pu induire des fréquences élevées de lymphocytes T antigènes spécifiques, produisant de l’IFNγ, la vaccination avec ces peptides n’a pas réussi à conférer une protection contre la croissance de cellules tumorales hyperploïdes.

L’échec de cette expérience pourrait être attribué à plusieurs causes. D’abord au fait que les peptides associés à l'hyperploïdie choisis ici n'étaient pas des néoantigènes (c'est-à-dire dérivés de mutations non synonymes). Des méthodes de séquençage à haut débit de l’exome permettant d’identifier des néoantigènes spécifiques à la ploïdie pourraient être envisagées dans des études futures. Ces approches ont montré qu’elles étaient efficaces pour prédire des peptides capables d’induire une réponse immunitaire anti tumorale efficace (Yadav, Jhunjhunwala et al. 2014), (Gubin, Zhang et al. 2014). Les protocoles de vaccination que nous avons utilisés auraient également pu être sous-optimaux. Par exemple, nous avons seulement vacciné les souris avec peptides spécifiques du CMH de classe I, en l’absence de peptides «helper» restreints au CMH de classe II. Il convient de noter que l'immunisation avec le même lot d'adjuvant utilisant un antigène spécifique de la tumeur (OVA dans le cas des cellules EG7 exprimant l'OVA, contenant des épitopes restreints aux CMH de classe I et de classe II) a conféré une protection et que la vaccination avec les peptides était très efficace pour susciter des réponses IFNγ spécifiques. Ainsi, l'échec des peptides induits par l’hyperploïdie, restreints au CMH de classe I, à induire une protection immunitaire pourrait également être dû à un manque de réponses des cellules CD4⁺. La plupart des vaccins peptidiques sont actuellement conçus pour activer les cellules T CD8⁺ cytotoxique du système immunitaire de l'hôte, qui jouent un rôle essentiel dans l'éradication des tumeurs (Slingluff 2011), (Fearon, Pardoll et al. 1990), (Golumbek, Lazenby et al. 1991), (Dranoff, Jaffee et al. 1993), (Kast, Offringa et al. 1989), (Riddell and Greenberg 1995). Cependant, certaines approches récentes ciblent les cellules T CD4⁺ helpers. Cela repose en partie sur les résultats d'études antérieures qui démontrent que la déplétion des cellules T CD4⁺ abroge totalement ou en partie de la réponse immunitaire protectrice aux vaccins (Kayaga, Souberbielle et al. 1999). En outre, la thérapie adoptive utilisant les lymphocytes T CD4⁺ a démontré qu'elle pouvait induire une protection tumorale dans certains modèles (Kahn, Sugawara et al. 1991). Un bénéfice clinique anecdotique a également été obtenu chez un patient après une thérapie adoptive avec des cellules T CD4⁺ réactives au mélanome (Hunder, Wallen et al. 2008). Les réponses immunitaires naturelles aux agents pathogènes incluent les réponses T helpers aux épitopes

présentés par les molécules CMH de classe II et les réponses CTLs aux épitopes présentés par les molécules MHC de classe I (Weiss, Sedegah et al. 1993). Les cellules T helpers peuvent activer les cellules dendritiques (DCs) pour augmenter leur présentation antigénique, qui en réponse produisent plus d’l'IL-2 ainsi que d'autres cytokines aidant à diriger la réponse immunitaire. Néanmoins, une aide Th1 forte produit un cocktail de cytokines approprié (IFNγ, TNFα, IL-2) qui est essentielle à l'induction de la destruction de la tumeur (Hung, Hayashi et al. 1998), (Matsui, Ahlers et al. 1999). De plus, on pense que les réponses T helper sont impliquées dans l'établissement de réponses mémoires (Pardoll and Topalian 1998). Ainsi, dans notre modèle, l'induction de cellules T CD4⁺ aurait peut-être pu permettre de créer des conditions dans lesquelles le système immunitaire des souris aurait été capable de rejeter les tumeurs hyperploïdes.

Comme nous n’avons pas pu identifier de peptides associés au CHM II capables de stimuler les cellules T CD4⁺, une autre approche aurait pu être de combiner notre vaccin avec des injections d’anticorps anti CD40. En effet il a été décrit que l’aide apportée par les cellules T CD4⁺ aux CTLs est médiée par la signalisation du récepteur CD40 (Bennett, Carbone et al. 1998), (Ridge, Di Rosa et al. 1998), (Lanzavecchia 1998), (Schoenberger, Toes et al. 1998). Ceci dit de nombreux protocoles classiques de vaccination permettent d’obtenir des réponses immunitaires anti tumorales avec des peptides associés au CMH I sans activation supplémentaire des cellules CD4⁺, avec une utilisation exclusivement d’agonistes de TLR en tant qu’adjuvants, comme la poly(I:C) (Gubin, Zhang et al. 2014) ou différents agonistes de TLR (van Duikeren, Fransen et al. 2012). Certaines études cliniques ont également démontré une perte d’efficacité dans l’activation de cellules T CD8⁺ lors de la combinaison de peptides associés au CMH I avec des petides helpers (Slingluff, Petroni et al. 2011), (Slingluff, Lee et al. 2013).

Enfin, il est possible que les clones hyperploïdes analysés dans notre modèle expérimental aient pu accumuler des variants pendant leur passage in vitro, les rendant hétérogènes par rapport à leurs caractéristiques antigéniques. Dans ce cas, seule une fraction des cellules tumorales générées in vitro serait éliminée suite à une réponse immunitaire spécifique. Certaines études suggèrent qu’un pool de peptides serait plus efficace pour palier à l’hétérogénéité tumorale et induire une réponse immunitaire efficace (Zhang, Zhang et al. 2008), alors que d’autres suggèrent au contraire qu’un de ces peptides deviendrait immunodominant, concentrant la majorité des réponses immunitaires, et ainsi donnant des résultats équivalentes à ceux obtenus avec des peptides administrés individuellement

(Matsushita, Vesely et al. 2012). Dans notre modèle expérimental, nous n'avons cependant pas détecté un seul cas dans lequel la vaccination avec un peptide aurait provoqué un retard même partiel dans la croissance tumorale, arguant contre la possibilité de l’hétérogénéité tumorale.

En conclusion, il semble que la polyploïdie augmente l'immunogénicité des cellules cancéreuses principalement - sinon exclusivement - par un effet sur l'adjuvanticité, au moins dans les modèles que nous avons étudiés jusqu'ici. Ces résultats confirment et nous permettent d’étendre notre observation antérieure selon laquelle l'hyperploïdie est fonctionnellement liée à l'exposition de CALR et que ces deux caractéristiques sont soumises à une sélection négative par un système immunitaire intact (Senovilla, Vitale et al. 2012), (Bloy, Sauvat et al. 2015), (Boileve, Senovilla et al. 2013). En effet, la déplétion de la protéine ERp57, requise pour l'exposition de la CALR (Panaretakis, Joza et al. 2008), (Panaretakis, Kepp et al. 2009), supprime l'immunoselection en faveur d'une ploïdie réduite (Senovilla, Vitale et al. 2012). De plus, une transfection stable de cellules avec un variant CALR qui est attaché à la surface de la membrane plasmique est suffisante pour empêcher la croissance de cancers in vivo (Senovilla, Vitale et al. 2012). Cette interprétation devrait susciter un intérêt renouvelé pour étudier la nature précise des signaux immunoadjuvants. Les méthodes génomiques et transcriptomiques peuvent être utiles pour l'identification des néoantigènes, mais ne conviennent pas pour l'étude des signaux adjuvants. Par conséquent, le répertoire des technologies nécessaires à l'immunogénicité du cancer liée à la thérapie doit être élargi à des méthodes permettant de détecter de manière adéquate le potentiel des cellules tumorales à émettre des signaux adjuvants.

Plusieurs données ont souligné l’importance de la phosphorylation de eIF2α dans l’induction d’une réponse immunitaire anticancéreuse contre les cellules hyperploïdes, et son intérêt comme marqueur de l’immunosélection des cellules hyperploïdes (Kepp, Semeraro et al. 2015), (Senovilla, Vitale et al. 2012). Les analyses de marquages de P-eIF2α sur des coupes immunohistochimique de tumeurs murines ou de patients étaient traditionnellement effectuées de manière manuelle, une méthode longue et présentant des risques de variabilité entre examinateurs.

Le présent travail a d’abord décrit un algorithme automatique disponible gratuitement pour le milieu de recherche

(https://fileshare.gustaveroussy.fr:443/easyshare/fwd/link=lMfqvir41hZeTLfQFT2QGD) qui permet la quantification de la surface nucléaire (corrélée à la ploïdie) ainsi que la quantification de la phosphorylation de eIF2α dans le cytoplasme des cellules tumorales soumises à la fixation, l’inclusion dans la paraffine et l'immunohistochimie. En utilisant cette méthode, nous avons pu montrer que les tumeurs qui se développent chez des souris fortement immunodéficientes suite à une exposition au carcinogène MCA, sont hyperploïdes et présentent une hyperphosphorylation de eIF2α par rapport aux tumeurs induites chez des souris immunocompétentes. Lors de leur injection dans des receveuses immunocompétentes, ces cellules cancéreuses hyperploïdes, présentant un stress du RE ne sont pas capables de former des tumeurs et déclenchent une réponse immunitaire anticancéreuse efficace et spécifique. Dans notre modèle expérimental nous n’avons pas mis en évidence une implication des cellules NK dans la reconnaissance et l’élimination des cellules hyperploïdes. L’absence de cellules B et T était suffisante pour que les cellules hyperploïdes prolifèrent. Il est néanmoins intéressant de noter que qu’un autre laboratoire a décrit que l'hyperploïdie induite par des agents polyploïdisants, stimule une réponse des cellules NK antitumorale médiée par les récepteurs NKG2D et DNAM-1 (Acebes-Huerta, Lorenzo-Herrero et al. 2016).

Bien que les analyses morphométriques se révèlent utiles, elles devraient être utilisées tout en tenant compte de plusieurs choses. Tout d'abord, la taille nucléaire est corrélée au contenu en ADN, mais n'est pas équivalente au contenu d'ADN, car la chromatine peut exister dans des degrés distincts de compactage et de condensation. Deuxièmement, l'hyperphosphorylation de eIF2α n'est pas le seul signe de stress du RE, et d'autres marqueurs potentiels (comme la présence du variant XBP1 épissé dans le noyau des cellules ou la présence d'ATF6 dans l'appareil de Golgi ou dans le noyau) doivent être explorés dans des études futures. Troisièmement, les analyses morphométriques ne peuvent pas facilement distinguer les cellules stromales et malignes, ce qui signifie que la zone d'intérêt sur laquelle l'analyse est effectuée doit être clairement définie, idéalement par un pathologiste qualifié.

Indépendamment de ces limites, les outils d'analyse morphométrique développés ici sont utiles pour des mesures quantitatives cellules par cellules, permettant d'identifier des populations rares, ainsi que des corrélations entre des biomarqueurs distincts dans différentes zones d’une même tumeur, contribuant à la description de l'hétérogénéité des cellules tumorales. En outre, les outils morphométriques sont susceptibles d'automatiser la caractérisation d'un grand nombre de tumeurs, y compris dans le contexte de microarrays tissulaires. En résumé, nous croyons que les techniques décrites, en particulier les outils d'analyse d'image appropriés,

faciliteront les futures études immuno-oncologiques en mesurant la taille nucléaire en tant que marqueur de substitution de la ploïdie, et la phosphorylation périnucléaire de eIF2α en tant que marqueur du stress du RE à l’échelle cellulaire.

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