Commentaire et expérience supplémentaires

Dans cet article, nous avons présenté la structure du HHD2 de la Whirline dans deux conformations : une forme globulaire à cinq hélices ainsi qu’une forme dimérique induite par échange de structure secondaire (swapped-dimère), où chaque protomère prend une conformation plane, comportant trois hélices. La différence de conformation est induite par la structuration des deux boucles "1/"2 et "3/"4 en hélices, fusionnant ainsi les hélices qu’elles connectent. Dans le swapped-dimère, les contacts entre hélices "2/"3 et "4/"5 sont conservés dans un protomère tandis que les contacts entre ces deux couples d’hélices sont eux satisfaits par la conformation en dimère. L’hélice "1 est en partie déstructurée.

Nous avons ensuite montré que la conformation observée en solution est la forme monomérique à 5-hélices, en attribuant les résonances des atomes du squelette de la protéine. Les expériences de RDC et des expériences complémentaires de SAXS (Figure 52) sont deux techniques moyennant la contribution de toutes les conformations présentes en solution. Elles indiquent sans ambiguïté que la forme à 5-hélices est la seule présente en solution et que l’hypothèse d’une faible population de swapped-dimère est écartée jusqu’à présent.

Figure 52 Diffusion aux petits angles de HHD2 en solution. (A) Courbe de diffusion des rayons X aux petits angles de HHD2 en solution. Le Rg et Dmax sont indiqués dans l’encadré. (B) Distribution de distances interatomiques déduites de la courbe SAXS de HHD2. Le chi2 du volume présenté en C, avec ces données, est indiqué sur le graphique. (C) Volume calculé ab initio depuis la P(r) de HHD2 en solution, par le serveur Dammin (embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/dammin).

Enfin, nous nous avons étudié la conformation et les interactions potentielles du domaine dans le contexte plus large de la protéine, pour obtenir des indications sur le rôle du domaine dans la Whirline. Nous avons montré par SAXS et RMN que la conformation du HHD2 n’est pas affectée par le tandem de PDZ le précédant. Dans une construction contenant les trois domaines, le HHD2 reste indépendant et séparé du tandem par une région flexible. Le N-terminal de la protéine forme un supramodule fonctionnel (section 9), l’absence

à la partie C-terminale de la protéine, formant un complexe avec la Myosine-15a et Eps8. Nous nous intéresserons l’interaction avec Eps8 dans la section 8.3.2.

8.3.1 Changement de conformation

Après avoir obtenu les deux conformations de HHD2, nous avons tenté d’induire, en solution, la transition de conformation du monomère vers le swapped-dimère. Il est généralement admis que les protéines Usher dimérisent ou oligomérisent pour effectuer leur fonction dans les stéréocils ^68,183. Les complexes protéiques impliqués dans les stéréocils effectuent leurs fonctions sans modification post-traductionnelle ; il existe donc des “interrupteurs” conformationnels permettant la transmission de l’information au sein de la cellule. Le domaine HHD2 de la Whirline nous semblait un bon candidat pour endosser cette fonction “interrupteur”, notamment dans l’isoforme courte de la Whirline. Nous avons fait varier le solvant contenant HHD2 pour obtenir des conditions favorables à la forme dimérique, sans succès jusqu’à présent. Voici une liste exhaustive des conditions testées : - Encombrement : favorable aux conformations exposant une surface minimum, il pourrait

favoriser la formation de swapped-dimère 266. La Whirline étant exprimée dans un

environnement confiné et très encombré, il était important de tester ces conditions, en simulant l’encombrement cellulaire. Nous l’avons testé en ajoutant 200 g/l de ficoll-70 dans la solution.

- Concentration en sel : lors de la déflection des stéréocils, le messager principalement de la mécano-transduction est l’entrée de cations dans la cellules. Nous avons donc testé des concentrations en NaCl variant de 150 mM à 500 mM.

- pH : dans la vision des drosophiles, un supramodule de domaine PDZ peut être désassemblé, libérant la fonction de l’un des domaines, lors d’un changement de pH lié à

la transduction du signal ^50,152. Nous avons enregistré les spectres du domaine entre pH 8

et pH 3.5.

- Température : les boucles charnières α1/α2 et α3/α4 sont plus dynamiques que le reste de la protéine d’après notre étude RMN. Nous avons donc tenté d’intensifier cette dynamique, en augmentant la température, créant un état favorable au dimère. Nous avons enregistré les spectres du domaine de 10 à 50°C.

- Alcool : la conformation en swapped-dimère en cristal a été capturée en présence de propan-2-ol (20%) ou d’éthanol (5%). Il est connu que alcool favorise la conformation en

hélice des protéines ²⁵⁵. Nous avons donc titré l’effet du propanol sur le domaine en solution.

- Oxydation : la stimulation trop longue des cellules ciliées induit l’accumulation d’espèces oxydantes en solution. Le HHD2 de la Whirline contient quatre méthionines oxydables

dans son cœur hydrophobe. Nous avons oxydé la construction en présence de H2O2 afin

de déstabiliser son cœur hydrophobe et induire la forme swapped-dimère.

- Acétylation : le HHD2 de la Whirline ne contient qu’une seule lysine (K473) dans 4. Dans la conformation à 5-hélice, celle-ci forme deux liaisons hydrogène avec E439 de l’hélice 4 et N469 de la boucle 3/4. Ces liaisons ne sont pas conservées dans la forme dimérique (Figure 53), et sont localisées autour des régions charnières. Nous avons ajouté de l’anhydride acétique afin d’acétyler cette lysine, supprimer les liaisons hydrogène et promouvoir la forme dimérique.

Figure 53 : K473 du HHD2. (A) Représentation de la K473 dans la conformation à 5-hélices, avec son réseau de liaisons hydrogène (B) Représentation de la K473 dans la conformation à 3-hélices.

Une dernière condition qu’il serait intéressant de tester est l’effet de la tension mécanique sur ce domaine. Comme nous l’avons présenté dans l’introduction, la mécano-transduction nécessite la présence de ressort moléculaire, encore non identifié. La flexibilité des régions charnières du HHD2 et la conformation alternative du domaine pourraient indiquer un changement conformationnel possible sous tension. Il serait intéressant de tester, expérimentalement ou par modélisation, l’impact sur sa conformation de la tension appliquée aux extrémités du domaine HHD2.

8.3.2 Tests d’interaction avec Eps8

Nous avons aussi étudié l’interaction possible de HHD2 de la Whirline avec Eps8. Les deux protéines interagissent et colocalisent en cellule. Ce complexe se forme entre le domaine

HHD2 ou la région riche en prolines de la Whirline et une grande région sans domaine

identifié de Eps8 ^211,226. En règle générale, les domaines HHD interagissent avec des hélices

amphiphiles isolées de leurs partenaires. Nous avons recherché dans cette région d’Eps8 des motifs potentiels d’interaction aux domaines. Nous avons identifié trois hélices d’une vingtaine de résidus chacune, que nous avons commandées par synthèse organique. Les premiers tests réalisés par RMN avec ces peptides n’ont pas montré d’interaction avec le domaine HHD. Nous sommes maintenant en train de délimiter des constructions plus grandes d’Eps8 afin d’identifier sa région d’interaction avec la Whirline, via le HHD2 et/ou avec la région riche en proline.