Commentaire & expériences complémentaires

Avec ces deux articles, nous avons déterminé la structure d’un supramodule formé de façon transitoire entre deux domaines PDZ. A ce jour, seules six structures de supramodule homotypique de domaines PDZ ont été résolues, une faible proportion comparée à leur occurrence dans le protéome (42 tandems en considérant un lien inter-domaine inférieur à 25 acides aminés). Toutes ces structures ont été obtenues par cristallographie, favorable à la détermination des objets les plus rigides. L’étude de complexe transitoire est difficile d’un point de vue expérimental et demande l’association de données de plusieurs méthodes biophysiques, intégrées par modélisation. Il est probable qu’une partie des tandems de domaine PDZ forme des supramodules similaires à ce que nous avons présenté et dont le caractère transitoire nécessite une approche intégrative pour la détermination de leur conformation.

9.4.1 Difficultés rencontrées avec l’étude des épingles-ß.

L’étude du tandem PDZ1-2 s’est avérée plus compliquée qu’initialement prévue par la présence des extensions en C-terminale de chaque domaine. Ces extensions se localisent à l’interface entre domaines PDZ et ne se structurent que dans le tandem et non dans les domaines isolés. La dynamique d’échange conformationnelle des épingles-ß aura rendu leur attribution difficile dans la construction du tandem, notre couverture d’attributions pour ces régions est bien moindre que dans le reste des domaines.

La structuration de l’épingle-ß du PDZ1 est fluctuante. La conformation de celle-ci est différente dans le tandem et dans le PDZ1 isolé (émission de fluorescence) ; elle n’est cependant pas affectée par la conformation ouverte ou fermée du tandem (HSQC). Son repliement induit de l’échange lent sur les résidus du PDZ1 qui sont à son contact (HSQC ;

appendice 12.2).

Le comportement de l’épingle-ß du PDZ2 est opposé à celui de l’épingle-ß du PDZ1. Sa présence induit de l’échange intermédiaire à la surface du PDZ2 dans le tandem. Par ailleurs, les mutations affectant la conformation du tandem ont un effet direct sur la dynamique conformationnelle de cette épingle-ß (HSQC ; appendice 12.2). Son tryptophane conservé (W375) est complétement exposé, et la mutation W375G n’affecte pas l’équilibre

L’absence d’interaction forte et directe entre domaine a rendu extrêmement difficile l’identification des perturbations dues au changement de conformation des épingles-ß ou au changement global de conformation du tandem. Nous avons ainsi dû multiplier les mutants et les expériences pour comprendre les modes de repliement de ces épingles-ß avant de pouvoir conclure sur les résultats présentés dans le second article sur l’interface entre PDZ.

Figure 65: Effet de la mutation PDZ1-2^!15 sur la conformation du tandem PDZ1-2. (A) Emission

de fluorescence de trois constructions de PDZ1-2 sauvage et mutantes. Le maximum d’émission de fluorescence du W237 dans la construction PDZ1-2 ^/15 est à 360 nm, son environnement est donc différent de celui dans la conformation native. (B) Distribution de distances interatomiques normalisées. La contribution de longues distances est plus importante dans le mutant court PDZ1-2 ^/15 que dans le sauvage. (C) CSP entre PDZ1-2 ^/15 et PDZ1-2 WT. Les plus fortes perturbations sont observées sur le PDZ2, l’épingle-ß du PDZ1 est aussi particulièrement affectée.

9.4.2 Rôle fonctionnel du tandem

Une question à laquelle nous tentons de répondre dans cet article est le rôle du tandem PDZ1-2 sur la fonction des domaines PDZ le composant. La présence de l’épingle-ß du PDZ1 améliore l’affinité du PDZ1 pour son ligand SANS d’un facteur 3-4. Cet effet significatif observé est un premier pas vers la compréhension du rôle du tandem sur la fonction de la protéine, mais nous ne sommes pas en mesure de conclure si cette augmentation modeste est déterminante dans la fonction physiologique du domaine.

Nous n’avons pas pu identifier de partenaires du PDZ2 sur l’ensemble des PBM de l’audition, nous laissant supposer que ce domaine est inactif, jusqu’à preuve du contraire.

d’interaction du domaine PDZ2, empêchant physiquement l’interaction avec un partenaire. Dans la moitié des tandems de PDZ dont la structure a été déterminée, l’un des deux domaines n’a pas de fonction d’interaction mais permet une régulation de la fonction de

l’autre domaine ^50,148,149. Il est probable que PDZ2 ait lui-même un effet modulateur

inductible sur la fonction du PDZ1, que nous n’avons pas pu identifier à ce jour. Pour étudier le rôle potentiel de l’équilibre ouvert/fermé sur la fonction de la Whirline, nous avons fait varier les conditions de solvant, dans le tube RMN. Les stéréocils des cellules ciliées sont un environnement particulièrement encombré, nous avons donc testé l’effet de l’encombrement stérique par ajout de ficoll (200g/l), sur les spectres HSQC du tandem, sans effet. Nous avons aussi testé l’effet de charge en variant la concentration de sel et le pH, cependant aucune de ces modifications du milieu n’a eu d’effet significatif sur l’équilibre ouvert/fermé du tandem.

9.4.3 Rôle de la séquence inter-domaine

La séquence connectant les deux domaines devrait être étudiée plus en détail. En effet, la structuration de l’épingle-ß du PDZ1, même dans le cas d’un mutant tandem ouvert, pourrait être une indication d’un rôle stabilisateur du lien. La prédiction de structure secondaire basée sur les résonances RMN, TALOS-N donne une faible prédiction d’hélice dans la partie C-terminale du lien, entre les résidus 260 et 270 ; cette région est aussi conservée dans les orthologues de Whirline. Des mutations, ponctuelles ou troncatures de cette région conservée, pourraient être envisagées pour évaluer son importance sur la conformation du supramodule. On peut notamment penser à substituer les résidus L259/R260 ou R267/S268 très bien conservés chez les orthologues afin de déstabiliser cette structure.

9.4.4 Contexte de la protéine entière

Une des questions récurrentes que nous nous posons concerne la relevance des observations faites sur ce tandem isolé dans le contexte de constructions plus grandes incluant notamment les domaines HHD adjacents.

Le travail présenté dans le chapitre précédent, sur le domaine HHD2, permet de répondre partiellement à cette question. Le domaine HHD2 est indépendant du tandem PDZ1-2. Une construction contenant les trois domaines ne présente pas de perturbations, ni sur les résonances des atomes du tandem PDZ1-2, ni sur les résonances des atomes du domaine HHD2, la conformation du tandem est donc très comparable dans le tri-domaine. D’un point

de vue fonctionnel, nous devrions mesurer l’affinité de la construction contenant les trois domaines pour l’un de ses partenaires et la comparer avec une valeur connue pour le tandem.

L’effet du HHD1 sur la structure du tandem est plus difficile à évaluer d’un point de vue expérimental. Comme décrit précédemment, celui-ci induit l’oligomérisation de toutes les constructions multi-domaines le contenant. Nous n’avons pas trouvé de conditions expérimentales satisfaisantes afin d’évaluer son effet sur la conformation du tandem PDZ1-2. Comme nous le présentons dans la figure de conclusion du second article, la superposition des structures du supramodule homotypique PDZ1-2 de la Whirline et du supramodule hétérotypique HHD-PDZ1 de l’Harmonine ne crée pas d’incompatibilité stérique entre le PDZ2 et le HHD. Il est donc possible qu’un supramodule de trois domaines se forme entre le HHD1 et le PDZ1-2 de la Whirline. Dans ce cas, l’équilibre conformationnel du tandem PDZ serait modifié.

Deux approches pourraient être entreprises pour étudier ce dernier point. Le suivi de la fluorescence des tryptophanes du tandem dans une construction plus large pourrait donner une première indication, mais la présence d’un tryptophane très certainement exposé dans le lien entre HHD1 et le PDZ1 pourrait compliquer l’interprétation des résultats. Nous envisageons également la production d’une construction HHD1-PDZ1-2. Si la conformation supramodulaire à trois domaines se confirme, il est probable que celle-ci rigidifie l’assemblage ainsi formé, qui pourrait avoir une plus grande chance de cristalliser. Sachant toutes les difficultés systématiquement rencontrées avec les constructions incluant HHD1, ce projet demandera encore beaucoup de mises au point biochimiques.