Partie IV : Immunothérapie dans les cancers colorectaux
B. Instabilité microsatellitaire (IMS)
3. Le CCR sporadique à IMS
Les CCR sporadiques à IMS sont souvent causés par l’hyperméthylation des îlots CpG
dans les régions promotrices des deux copies du gène MLH1
375. Des mutations des gènes
MSH2, MSH6, MLH3, PMS2 et EXO1 peuvent également jouer un rôle dans le
développement de ces CCR sporadiques à IMS
383.
Dans les deux types de CCR à IMS (syndrome de Lynch et CCR sporadique),
l'inactivation du système MMR conduit à l'accumulation d’insertions et de délétions dans les
séquences répétées d'ADN du génome du patient, et finalement à d'autres mutations de
l'ADN. Plusieurs mutations décalant le cadre de lecture résultant du défaut du système MMR
ont été directement liées au développement de CCR à IMS.
Les néoantigènes tumoraux dans les CCR à IMS : « Frameshift Peptides
» (FSP)
Avec le défaut de l'activité MMR, les mésappariements, insertions et délétions
s’accumulent rapidement. Il a été observé qu’en moyenne, environ 1 300 substitutions de
bases sont acquises chez les patients atteints de syndrome de Lynch, alors que seulement 190
substitutions de bases sont présentes dans les tumeurs à microsatellites stables
384. De même,
les CCR sporadiques à IMS ont un nombre nettement plus élevé de substitutions de bases par
rapport aux CCR à MSS. En plus de ces substitutions de bases, un grand nombre d'insertions
et de délétions est observé dans les CCR à IMS. Lorsque ces insertions ou délétions se
produisent au niveau de séquences répétées codantes du génome, cela conduit à un décalage
du cadre de lecture des gènes affectés. Ces mutations décalant le cadre de lecture peuvent se
produire dans des gènes suppresseurs de tumeur spécifiques, qui sont sensibles à ces
mutations car ils contiennent des séquences répétées codantes
385. Par exemple, des mutations
78
du cadre de lecture sont fréquemment observées dans les séquences répétées
mononucléotidiques de gènes suppresseurs de tumeurs comme APC, BAX et TGFβR2
386. Ces
mutations somatiques décalant de lecture dans les gènes APC, BAX et TGFβR2 sont
respectivement observées dans environ 70%, 50% et 90% des CCR à IMS.
Les mutations décalant le cadre de lecture peuvent conduire à la génération de
nouvelles protéines fragmentées en peptides appelés « frameshift peptides » (FSPs)
307. Ces
néoantigènes suivent la voie classique de dégradation des protéines par le protéasome et les
néopeptides résultant de cette dégradation sont transportés dans le réticulum endoplasmique
par la machinerie TAP pour accéder aux molécules du CMH. Lorsque les peptides se lient aux
molécules du CMH-I, le complexe CMH-peptide ainsi assemblé quitte le RE pour être
présenté à la surface de la cellule. Au sein de chaque tumeur, des néoantigènes spécifiques
s’accumulent. L'accumulation d'environ 40 épitopes uniques pour l'ensemble des molécules
du CMH-I par individu atteint d’un CCR à IMS a été observée
388.
Les néopeptides issus de la fragmentation de néoantigènes sont potentiellement
immunogènes. Parmi les FSP, le premier à avoir été décrit comme immunogène est FSP02
(RLSSCVPVA). Il dérive de la fragmentation d’un néoantigène issu de la mutation (-1) du
gène codant le récepteur du TGFβ de type II (TGFβRII (-1)). Cette mutation se produit dans
une séquence poly A (10 résidus Adénine) de l’exon 3 du gène TGFβRII (Figure 17)
307. Les
FSP possédant une affinité suffisante pour les molécules du CMH de classe I exprimées par
l’individu sont présentés à la surface des cellules tumorales aux LT. Ces FSP sont capables de
stimuler fortement les LTC lorsqu’ils sont présentés de manière immunogène par des cellules
présentatrices d’antigène. Il en résultera une destruction spécifique des cellules tumorales
présentant ces néopeptides. Chez les patients atteints d’un CCR à IMS, la réponse
immunitaire anti-tumorale spécifique des FSP suggère que ces peptides pourraient être utilisés
comme antigènes cibles pour une immunothérapie anti-tumorale spécifique personnalisée
389.
79
Figure 17 : Mutation par décalage du cadre de lecture - exemple du gène du récepteur du TGFβ de type II (TGFβRII)
La perte d’une adénine dans la séquence codante de 10 A de ce gène décale le cadre de lecture et engendre la synthèse d’une nouvelle protéine contenant la séquence peptidique RLSSCVPVA, appelée FSP02.
Réponse immunitaire dans les CCR à IMS
Chez un individu sain, le principal chef d’orchestre de la réponse immunitaire est la
cellule dendritique qui patrouille dans tout le corps à la recherche de signaux de danger ou de
signes d'inflammation. Une fois qu'elle détecte des cellules tumorales ou des particules
nécrotiques, elle peut s'activer, endocyter des antigènes tumoraux exogènes, apprêter ces
antigènes tumoraux par différentes voies lytiques et présenter des épitopes tumoraux qui en
dérivent sur les molécules du CMH-I et du CMH-II à sa surface. Par la suite, elle migre à
travers le système lymphatique vers les ganglions lymphatiques où les LB et les LT résident.
Comme mentionné précédemment, les LT jouent un rôle central dans la réponse
anti-tumorale. Les LT CD4
+sont capables d'initier une commutation isotopique des LB et peuvent
favoriser l'activation des LTC. Après l'activation des LT CD4
+suite à l’interaction avec les
cellules dendritiques exprimant des complexes CMH-II/antigène et des molécules
co-stimulatrices, les LT CD4
+deviennent matures et entrent dans la circulation. Ces cellules
80
expriment le ligand de CD40 et soutiennent les cellules dendritiques pour la stimulation et la
différenciation des LTC par l’interaction avec CD40, ou directement par la production de
cytokines. En revanche, quand les LTC sont activés, ils migrent vers le tissu tumoral pour
remplir leur fonction effectrice. Ceci implique l'induction de l'apoptose par la production de
perforine et de granzymes lors d'un contact avec des cellules tumorales portant le complexe
CMH-peptide spécifique contre lequel le LTC a été activé. Les LTreg, exprimant CD25 et
FoxP3, peuvent également être retrouvés dans le microenvironnement tumoral. Dans les
organes lymphoïdes secondaires, ils maintiennent la tolérance aux auto-antigènes par la
suppression ou la régulation négative des LT effecteurs auto-réactifs en inhibant leur
prolifération, alors que dans le microenvironnement de la tumeur, ils peuvent activement
supprimer la réponse anti-tumorale.
Une densité importante de LT infiltrant les tumeurs représente une caractéristique
commune des CCR, et en particulier des CCR à IMS
182. En effet, les CCR à IMS sont
caractérisés par une densité plus importante de lymphocytes infiltrant la tumeur, associée à un
meilleur pronostic
97. Dans les CCR à IMS, il a été trouvé un plus grand nombre de LTC CD8
+actifs et un pourcentage plus important de cellules cancéreuses subissant l’apoptose. De plus,
les cellules apoptotiques étaient majoritairement localisées à proximité des cellules CD8
+,
suggérant que ces LTC élimineraient ces cellules tumorales
390. Des études in vitro et in vivo,
phénotypiques et histopathologiques, ont démontré que LT CD4
+et LTC sont attirés dans le
tissu tumoral et sont réactifs contre des épitopes spécifiques de la tumeur
182,300,389,391–393. Ces
LT sont spécifiques de néoépitopes résultant de mutations décalant le cadre de lecture. En
plus de mutations décalant le cadre de lecture de gènes suppresseurs de tumeur précédemment
mentionnés comme APC (impliqué dans la voie Wnt), BAX (lié à l'apoptose) et TGFβR2
(impliqué dans la transduction du signal), des mutations décalant le cadre de lecture sont aussi
fréquemment identifiées dans les gènes TP53 (rôle dans l'apoptose, la stabilité génomique et
l'inhibition de l'angiogenèse), OGT (impliqué dans la translocation et la modification de
protéines), et CASP5 (rôle dans l'inflammation)
394–397. Des réponses T cytotoxiques
spécifiques chez des patients ayant un CCR sporadique à IMS ont été observées contre des
peptides dérivés de ces mutations d’OGT
394, de TGFβRII
393et de CAPS5
392. Par rapport aux
CCR à MSS, les cellules dendritiques dans les CCR à IMS expriment des niveaux plus élevés
de molécules co-stimulatrices, ce qui est nécessaire pour une activation correcte des LT. Ceci
est probablement dû à la forte immunogénicité des tumeurs à IMS, qui expriment des niveaux
élevés de molécules activatrices du système immunitaire telles que des protéines de choc
81
thermique et des cytokines pro-inflammatoires, et sont donc extrêmement efficaces dans le
déclenchement de l'activation des cellules dendritiques
398. Une surexpression de l'intégrine
CD103, impliquée dans la migration des LT, a été observée sur les LT CD8
+infiltrant les
tumeurs à IMS, ce qui n'a pas été observé dans les tumeurs à MSS
399. Une concentration
élevée de granzyme B et de perforine dans les LT CD8
+infiltrant les tumeurs à IMS a
également été observée, soulignant leur statut réactif dans les tumeurs à IMS
390,398,400. De
plus, dans les tumeurs à IMS, les LT CD4
+secrètent des quantités élevées de cytokines
pro-inflammatoires qui influencent positivement la réponse anti-tumorale
398. Cette action
concertée des LT CD4
+et des LTC a été considérée comme une condition préalable pour une
réponse immunitaire anti-tumorale efficace et a été corrélée avec une survie plus élevée des
patients atteints de CCR à IMS
401,402. Les LTreg peuvent affecter négativement la réponse
anti-tumorale par la suppression des LTC. Dans certaines études, il a été observé que les
LTreg augmentaient leur niveau d’expression de CD103 et étaient capables d'infiltrer les
tumeurs dans les CCR à IMS, mais pas dans les CCR à MSS. Cette infiltration des LTreg était
négativement corrélée avec une réponse efficace des LTC anti-tumoraux
97,403. Il a été
également démontré qu’un ratio plus élevé de LT CD8
+/LTreg était corrélé avec un meilleur
pronostic dans les CCR à IMS
404. Le ratio LT CD8
+/LTreg pourrait donc être utilisé comme
marqueur pronostique chez les patients atteints de CCR à IMS. Dans le même ordre d’idée,
des études in vitro évaluant l'impact des LTreg sur les LTC spécifiques de FSP, ont montré
que la déplétion des LTreg pourrait promouvoir l'activité des LTC
405et que les antigènes qui
sont reconnus par les LTreg pourraient avoir un impact sur leur capacité à supprimer les LT
CD8
+. Contrairement à ces études, d’autres équipes ont découvert avec surprise que l’infiltrat
en LTreg pourrait être associé à un bon pronostic
98–100. Dans une étude réalisée par notre
équipe sur les CCR à IMS, la densité de lymphocytes FoxP3
+infiltrant la tumeur a été
clairement associée à des caractéristiques tumorales moins invasives, et pourrait donc être
indirectement associée à un meilleur pronostic
101. De façon surprenante, Le Gouvello et
collaborateurs ont révélé que les niveaux d'expression des ARNm de FoxP3, indiquant la
présence de LTreg, étaient augmentés dans les tumeurs à MSS par rapport aux tumeurs à
IMS
406. Tous ces résultats contraires indiquent que plus de connaissances doivent être
acquises pour comprendre pleinement le rôle des LTreg dans les tumeurs à IMS et à MSS.
En somme, une réponse immunitaire anti-tumorale efficace peut être déclenchée si la
tumeur contient des protéines mutées qui sont présentées sur des molécules du CMH-I et
reconnues comme non soi ou soi modifié par les LT. Plusieurs types de cellules immunitaires
82
ont un effet positif sur la réponse anti-tumorale, telles que les LTC infiltrant les CCR. Le fort
infiltrat lymphocytaire, la réaction inflammatoire marquée et le bon pronostic associés aux
CCR à IMS pourraient être expliqués par le statut particulier de ces tumeurs dans lesquelles
des néoantigènes fortement immunogènes spécifiques des cellules cancéreuses sont observés.
Approches d’immunothérapie dans les CCR à IMS
Le traitement actuel des CCR est basé principalement sur la chirurgie, la radiothérapie
et/ou la chimiothérapie, en fonction du stade de la maladie. Induire des réponses durables à
ces traitements reste difficile en raison de certaines différences observées entre les patients,
telles que l'âge, mais aussi des influences génétiques inconnues et des différences dans les
mécanismes d’échappement de la tumeur. Le groupe de Lynch a montré déjà en 1997 que les
patients atteints de syndrome de Lynch par rapport aux patients atteints d’un CCR sporadique
à IMS avaient une chance beaucoup plus élevée de survie à cinq ans
407. En raison de fortes
réponses immunitaires possibles contre des néoantigènes trouvés chez les patients atteints de
CCR à IMS, l'immunothérapie visant à étendre et à renforcer ces réponses présente un grand
intérêt. Récemment, deux études ont analysé les effets du microenvironnement tumoral des
CCR à IMS et des molécules inhibitrices présentes sur les lymphocytes infiltrant les tumeurs
spécifiques de néoantigènes
408,409. Le groupe d’Housseau a rapporté que les tumeurs à IMS
n’étaient pas totalement éliminées malgré les grandes quantités de lymphocytes infiltrant les
tumeurs. En faisant de l’immunohistochimie, de la microdissection laser, de la qRT-PCR, de
la cytométrie en flux et des analyses fonctionnelles, ils ont découvert qu'une grande quantité
de molécules inhibitrices était exprimée dans les tumeurs MMR-déficientes et dans leur
microenvironnement, notamment PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 (Lymphocyte Activation
Gene 3) et l’indolamine-2,3-dioxygénase. Par conséquent, les tumeurs à IMS qui expriment
des quantités élevées de néoantigènes pourraient augmenter leur niveau d’expression de
molécules inhibitrices pour contrebalancer la grande quantité de cellules immunitaires
infiltrantes. En outre, les inhibiteurs de « checkpoints » pourraient être particulièrement
efficaces dans ce sous-type de CCR
408. Dans un essai clinique de phase I, Le et ses
collaborateurs ont noté que seulement un sur 33 patients atteints de CCR répondait à un
anticorps monoclonal anti-PD-1
6,198. Cette observation les a amenés à étudier la cause de cette
réponse unique. Il s’est avéré que ce patient avait un CCR à IMS. Par la suite, un essai
clinique de phase II a été lancé pour tester l'efficacité d’un anticorps monoclonal anti- PD-1,
83
le pembrolizumab, chez des patients atteints d’un CCR à IMS ou à MSS, et a souligné un net
avantage du traitement pour les patients atteints de CCR à IMS
409. Une autre stratégie
exploitant le système immunitaire pour lutter contre les CCR à IMS est basée sur les vaccins à
base de néoantigènes
410,411. Brièvement, des vaccins à base de néoantigènes pourraient être
développés grâce à l'analyse du génotype des cellules tumorales et à la prédiction par des
algorithmes, in silico, de néopeptides tumoraux, complétée par des tests fonctionnels
d’immunogénicité. Les peptides prédits pourraient également être utilisés pour une ICA ou
pour des vaccins à base de cellules dendritiques.
Les néoantigènes ne sont pas exprimés dans le thymus, ils ne subissent donc pas la
sélection négative, et sont du coup potentiellement plus immunogènes que les autres types
d’antigènes associés aux tumeurs. Dans les CCR à IMS, la vaccination avec des néoantigènes
immunogènes pourrait augmenter l'immunité des LT spécifiques de la tumeur in vivo.
L’utilisation de néoantigènes pour une thérapie vaccinale ou de néopeptides pour une ICA
personnalisée présente donc un grand intérêt potentiel. Toutefois, plusieurs limites doivent
être prises en considération. Tout d'abord, il convient d’identifier les néoantigènes et les
néoépitopes dérivés de ceux-ci spécifiques de la tumeur du patient. Ensuite, il convient de
valider l’immunogénicité de ces néoantigènes et de ces néopeptides, notamment en étudiant
les réponses des LT qu’ils génèrent. Le développement de stratégies d’immunothérapie
spécifique de néoantigènes issus d’un décalage du cadre de lecture présente un réel potentiel
clinique.
Les cellules présentatrices d’antigène artificielles (CPAA) développées
au laboratoire, utilisées dans le cadre des CCR à IMS
Dans le but de proposer une stratégie d’immunothérapie basée sur le transfert adoptif
de LT, un système artificiel de présentation d’antigène a été développé au laboratoire à partir
de fibroblastes murins NIH/3T3
277, par transfert de gènes grâce à cinq vecteurs
gammarétroviraux codant respectivement les molécules accessoires B7.1, ICAM-1 et LFA-3,
la β2-microglobuline humaine et une chaîne lourde HLA de classe I, recréant ainsi une
véritable synapse immunologique (Figure 18). Les cellules présentatrices d’antigène
artificielles (CPAA) présentant l’antigène au sein de la molécule HLA de classe I A2.1, la
plus fréquente, exprimée par environ 40% des individus, sont les plus utilisées au laboratoire.
Il est important de préciser que ces CPAA sont capables de présenter un peptide immunogène
84
d’intérêt directement transduit, mais aussi de dégrader des antigènes entiers transduits et de
les présenter sous forme de peptides immunogènes, comme le font des cellules humaines
412.
Les LT activés par des CPAA exprimant la protéine entière antigénique ou le peptide d’intérêt
vont entraîner une lyse cellulaire spécifique. L’antigène est codé par un vecteur
gammarétroviral dicistronique dans lequel le transgène d’intérêt est lié à une séquence codant
la puromycine-N-acétyltransférase par un élément IRES (Internal Ribosome Entry Site),
permettant la sélection des cellules transduites par la puromycine. Ces CPAA présentent de
nombreux avantages puisqu’elles se multiplient rapidement, constituent des lignées stables et
sont très facilement transductibles. Elles permettent d’induire une réponse immunitaire
cellulaire anti-virale ou anti-tumorale spécifique en activant efficacement et de façon
reproductible des LTC spécifiques. Elles nous ont permis d’activer des LTC spécifiques
d’antigènes viraux comme FMP (Flux Matrix Protein), pp65, protéine structurale du CMV
(Cytomégalovirus), mais également des antigènes tumoraux tels que MART-1 (Melanoma
Antigen Recognized by T cells-1), gp100 et hTERT (human Telomerase Reverse
Transcriptase)
277.
Dans le cadre des CCR à IMS, des CPAA A2.1+ ont été développées au laboratoire,
qui codent des néoantigènes spécifiques des tumeurs, sous forme de néopeptides
restreints ou sous forme de protéines entières, dégradées par ces CPAA en néopeptides
A2.1-restreints.
85
Figure 18 : Cellules présentatrices d’antigène artificielles (CPAA)
Parmi les systèmes de présentation d’antigène artificiels cellulaires, des CPAA ont été générées à partir de fibroblastes murins transduits séquentiellement grâce à des vecteurs gammarétroviraux codant la chaîne lourde HLA A2.1, la β2 microglobuline (β2m) et un antigène sous forme de peptide (Pep) ou de protéine (Prot) afin de reconstituer le complexe du CMH de classe I. Ces cellules ont été également transduites avec trois molécules accessoires (B7.1, ICAM-1 et LFA-3). Ce système est capable d’activer et d’amplifier des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Ce sont des lignées stables, facilement transductibles, et aucune xénoréactivité n’a été observée avec ce système dans les conditions de coculture établies.
LTR : Long Terminal Repeat
SD : Site Donneur d’épissage SA : Site Accepteur d’épissage Ψ + : signal d’encapsidation
PuroR : « gène » de résistance à la puromycine
GAG/POL/ENV : protéines gammarétrovirales codées par la cellule productrice de virus
Cellule productrice de virus
SD Ψ +SA GAG/POL/ENV Ψ + ENV Ψ + GAG/POL Particules virales ARN ADN Transcription inverse intégration génomique
NIH/3T3
LTR LTR β2m/Molécules accessoires SD Ψ +SA HLA.A2.1 SD Ψ +SA Pep/Prot PuroR SD Ψ +SA86