La cartographie et carte fine des gènes
6.5 LA CARTOGRAPHIE FINE PAR TEST MULTIPOINT
Ordonner des gènes ou des sites sur un axe peut être réalisé par le calcul de leurs distances respectives, ce qui suppose que le nombre de gamètes étudiés est d’autant plus élevé que les distances sont courtes.
Si les conditions expérimentales limitent ce nombre et ne permettent pas d’estimer avec précision les distances, il peut être utile de définir un test, plus quali-tatif que quantiquali-tatif, fondé sur l’observation d’un type particulier de gamètes dans des croisements parallèles, les souches croisées étant définies de manière telle que ce gamète sera très rarement, voire jamais formé dans un des croisements.
Supposons que trois sites de mutations d’un même gène, notés s1, s2 et s3 doivent être ordonnés, trois ordres sont possibles selon que s1 ou s2 ou s3 est central.
Dans un tel but on peut, à condition d’en disposer, faire trois croisements paral-lèles entre un double mutant pour deux des sites et le simple mutant pour le troi-sième, et observer lequel des croisements ne donne jamais de gamètes sauvages; on peut alors en conclure que le site du mutant simple de ce croisement est le site central (tabl. 6.1).
Ce genre de croisement et de test des gamètes est assez facile chez la levure où des milliers de spores peuvent être déposées sur une boîte où seules les sauvages peuvent donner des colonies, ou chez la drosophile si un test cross permet aux seules sauvages F2 de se développer.
Il existe des variantes plus simples, notamment quand on ordonne deux à deux les sites d’un même gène par rapport à une mutation externe responsable d’un phéno-type différent, pouvant lui-même servir de crible de sélection (voir exercice d’appli-cation et de génétique bactérienne); dans ce cas il y a deux cartes possibles (le marqueur externe ne pouvant être central) et il convient de comparer les résultats de deux croisements.
G– H+ G– H+
Délétion du parent A G– H–
Figure 6.3.
Le premier diploïde ne donnera jamais de gamètes sauvages. Le deuxième diploïde donnera quelques gamètes sauvages si le nombre de gamètes étudiés, c’est à dire de méiose, est élevé (seules deux chromatides homologues non sœurs ont été figurées).
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On peut enfin définir un test quatre points où on ordonne deux à deux des sites de mutations en les positionnant par rapport à deux mutations extérieures situées de part et d’autre (voir exercices).
La plupart du temps, ces tests nécessitent de comparer entre eux les résultats de plusieurs croisements parallèles, ce qui n’a de sens que si les observations ne dépen-dent que de la position des sites et d’aucun autre paramètre; on verra que dans certaines conditions, avec des marqueurs de sélection supplémentaires, on peut raisonner à l’intérieur d’un seul croisement et s’affranchir ainsi des paramètres qui, en dehors de la position des sites, sont susceptibles de jouer sur l’efficacité du croi-sement à générer les recombinants (voir exercice de génétique bactérienne).
EXERCICES
Exercice 6.1
En 1986, le gène humain impliqué dans la mucoviscidose, appelé depuis CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) n’avait pas encore été cloné et sa fonction était encore inconnue, même si elle était suspectée (canal ionique chlorure).
TABLEAU 6.1 TESTTROISPOINTPERMETTANTD’ORDONNERLESMARQUEURS. Le but est d’identifier, en fonction de l’ordre possible des 3 marqueurs, le croise-ment entre doubles et simples mutants où la formation d’un gamète sauvage est la plus rare, parce qu’exigeant un double crossing-over.
Ordres possibles
Si, des trois croisements réalisés, c’est le deuxième qui donne rarement, voire jamais, de gamètes sauvages,
on peut conclure que le site s3 est central.
s2 central
Par analyse de liaison génétique, on a montré que le gène CFTR était lié (distance égale à 15 cM) à un marqueur polymorphe de l’ADN dont les fragments de digestion (par l’enzyme Hinc II) sont reconnus par une sonde spécifique LAM4-917, mais ce marqueur polymorphe, nommé DOCRI-917 n’était pas encore lui-même assigné à un chromosome.
On a alors extrait l’ADN de plusieurs lignées hybrides homme-rongeur qu’on a digéré par Hinc II; les fragments ont été ensuite séparés par électrophorèse puis transférés, après dénaturation de l’ADN, sur une membrane de nylon; ces Southern blot ont été hybridés par la sonde marquée LAM4-917 (tabl. 6.2, colonne a).
Par la suite, on a réhybridé les Southern blot par une autre sonde marquée, TCRB, correspondant à la séquence du gène du récepteur β de lympho-cyte T (tabl. 6.2, colonne b), localisé sur le chromosome 7. Interprétez ces résultats en justifiant les choix de sondes.
➤ Niveau Licence/Définitions des objectifs.
Assignation (localisation) chromosomique d’un gène humain par panel d’hybride homme-rongeur.
Solution. Le but de ce protocole est d’assigner le gène CFTR à un chromosome en assignant le marqueur DOCRI-917 qui lui est génétiquement donc physiquement lié.
Le gène CFTR ne peut être directement utilisé pour cette localisation, puisque sa séquence est indisponible, le gène n’étant pas encore cloné, et que son produit encore inconnu ne peut être dosé dans des extraits acellulaires de cellules hybrides.
On attend, de l’hybridation avec la sonde, un signal positif si le chromosome porteur de DOCRI-917 est présent, et l’absence de signal s’il est absent. L’incohérence de résultat pour un chromosome donné (signal d’hybridation présent en absence de ce chromosome chez
TABLEAU 6.2 ASSIGNATIONCHROMOSOMIQUEDUGÈNE CFTR.
Colonne a, signal d’hybridation de l’ADN des lignées avec la sonde LAM4-917; colonne b, signal d’hybridation avec la sonde TCRB.
(+) indique un signal d’hybridation et (–) son absence.
Chromosomes humains conservés (+) ou perdus (–) dans chacune des lignées hybrides homme-rongeur
Lignée
hybride 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y a b
1 – – + + + – – + + – + + – + – + + – + + + – – – – – 2 + + + – – – – – + + + – – – + – + – – + + + – – – – 3 + – – + – – + + – – – + + – + – – + – – + – + + + +
4 + + – – – + + – + – – – – + – + – – + – – – – + + +
5 – – – – + + + – – + + + + – – – + + + – – + – – + +
6 + + + – – + – – + – – – + – – + – + – + – + + – – –
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l’hybride cellulaire, ou signal d’hybridation absent en présence de ce chromosome) exclut alors ce chromosome comme porteur du marqueur DOCRI-917 et donc du gène CFTR.
La sonde LAM4-917 donne un signal d’hybridation avec l’ADN des lignées 3, 4 et 5 et un signal négatif avec les autres. Si on considère les chromosomes conservés ou perdus par les différentes lignées, les résultats observés sont toujours incohérents, sauf avec le chromosome 7, ce qui permet de localiser DOCRI-917 et le gène CFTR sur le chromosome 7.
L’hybridation avec le gène TCRB joue le rôle de contrôle, montrant que les Southern blot répondent bien de façon attendue, positive ou négative, à l’hybridation d’une séquence connue pour être localisée sur le chromosome 7.
Exercice 6.2
On a isolé un mutant albinos dans une lignée pure de souris nommée CD1.
Une étude génétique a permis de montrer que ce mutant était récessif et muté dans un seul gène (3/4 de sauvage et 1/4 d’albinos à l’issue d’un croi-sement F1 × F1).
On souhaite « assigner » ce gène à un chromosome, c’est-à-dire identifier le chromosome où réside le locus de ce gène. Dans ce but, on croise des mutants albinos de la lignée CD1 avec des individus de la lignée 129, sachant que ces deux lignées diffèrent l’une de l’autre pour de nombreux marqueurs VNTR identifiés et cartographiés.
Les marqueurs VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) sont des séquences d’ADN formées d’un nombre variable d’un motif répété, souvent un di ou un trinucléotide. Ce « polyallélisme » génère dans une population naturelle un grand nombre de génotypes différents les uns des autres et entre eux, ce qui constitue la base des méthodes d’empreintes génétiques.
Dans les lignées pures de souris, tous les individus sont homozygotes pour un allèle du marqueur mais les lignées diffèrent les unes des autres, les individus n’étant pas homozygotes pour le même allèle du marqueur.
Les F1 sont croisées entre elles et on récupère les F2 albinos; on entre-prend alors une « revue génomique » (génome scan) qui consiste à déter-miner, pour tous ces individus, le génotype dont ils sont porteurs pour toute une série de ces marqueurs moléculaires répartis sur les différents chromosomes, dont les marqueurs D4M24, D5M8 et D7M52 (tabl. 6.3).
– D4M24 est le marqueur 24 du chromosome 4, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 32 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 22 répétitions;
– D5M8 est le marqueur 8 du chromosome 5, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 8 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 12 répétitions;
– D7M52 est le marqueur 52 du chromosome 7, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 9 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 17 répétitions.
Sur quel chromosome peut-on assigner la mutation albinos de la lignée CD1 ? Justifier les réponses par un schéma.
➤ Niveau Licence (L1, L2)/Définition des objectifs.
Assignation (localisation) chromosomique par revue génomique (exemple chez la souris).
Solution. La méthode consiste à assigner un gène à un chromosome en montrant qu’il est génétiquement lié à un marqueur moléculaire connu de ce chromosome. Les croisements entre albinos CD1 et non-albinos 129 génère des hétérozygotes pour tous les gènes, et notamment les marqueurs, dont l’allèle est différent d’une lignée pure à l’autre; c’est le cas pour le gène impliqué dans l’albinisme, dont les allèles seront notés A et a, comme pour les trois marqueurs étudiés.
Le génotype des F1 est figuré ci-dessous; les pointillés désignent une éventuelle liaison avec l’un des trois marqueurs (les trois étant physiquement indépendants entre eux) :
En cas d’indépendance génétique entre le couple d’allèles A/a et un marqueur donné, les F2, qu’ils soient A//A, A//a ou a//a seront, pour le marqueur considéré, homozygotes pour l’un des allèles avec une probabilité égale à 1/4 et hétérozygotes avec une probabilité égale à 1/2.
C’est effectivement ce qu’on observe pour D4M24 et D7M52; attention cette observation, en elle-même ne permet pas d’exclure que le gène A soit sur le chromosome 4 ou sur l7, mais permet d’exclure qu’il soit sur le 4, dans le voisinage de D4M24 et sur le 7, dans le voisinage de D7M52. N’oublions jamais que deux gènes ou marqueurs peuvent être physiquement liés tout en étant génétiquement indépendants.
En cas de liaison génétique entre le couple d’allèles A/a et un marqueur donné, les allèles A auront tendance à coségréger, à la méiose chez la F1, avec l’allèle marqueur du parent 129, et les allèles a auront tendance à coségréger avec l’allèle marqueur de la lignée CD1.
En conséquence, les albinos F2, de génotype a//a, seront beaucoup plus souvent homo-zygotes pour l’allèle CD1, parfois hétérohomo-zygotes, et plus rarement homohomo-zygotes pour l’allèle 129, puisqu’alors ils seraient issus de deux gamètes, paternel et maternel, résultant tous deux d’un crossing-over entre le gène et le marqueur.
TABLEAU 6.3 GÉNOTYPESDESTROISMARQUEURS VNTR ÉTUDIÉSDES F2
DEPHÉNOTYPEALBINOS.
Les allèles de chacun des marqueurs sont définis par leur nombre de répétitions, (entre parenthèses, effectifs observés de chacun des génotypes).
Marqueur D4M24 Marqueur D5M8 Marqueur D7M52
32//32 (24)
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C’est ce qu’on observe pour le marqueur D5M8; on peut en conclure que la mutation albinos de CD1 touche un gène du chromosome 5, dans le voisinage du marqueur D5M8.
Exercice 6.3
Dans tout l’exercice, on ne tiendra pas compte du type sexuel, a ou α, des souches de levure Saccharomyces cerevisiae, on suppose qu’on dispose toujours d’une souche du type sexuel requis pour le croisement, ainsi que des marqueurs de sélection des diploïdes.
On dispose d’une souche haploïde A, auxotrophe pour l’isoleucine et la valine, phénotype noté [ilv–] deux acides aminés dont la chaîne de biosynthèse comprend une partie commune, et d’une souche B, auxo-trophe pour la méthionine, phénotype noté [met–].
1.On réalise le croisement de A par B puis on étudie les spores issues de la méiose des diploïdes; on observe 4 250 spores [ilv–], 4 230 spores [met–], 140 spores [ilv–, met–] et 120 spores [ilv+, met+]. Quelles conclusions peut-on en tirer ?
2.À partir de la souche A, on a isolé un grand nombre de mutants indépen-dants, auxotrophes pour le tryptophane, phénotype noté [trp–]; on étudie quatre mutants nommés t1, t2, t3 et t4.
– Les quatre mutants sont croisés avec la souche B, les diploïdes sont sauvages.
– Les quatre mutants sont croisés deux à deux, les diploïdes sont tous [trp–].
Que conclure ?
3.Les diploïdes issus du croisement du mutant t1 avec B sont mis à sporuler. On étale environ 10 000 spores sur des boîtes de milieu Mo additionné de tryptophane, de méthionine, de valine et d’isoleucine;
4 980 colonies sont capables de pousser, après réplique sur Mo additionné de méthionine, de valine et d’isoleucine. On obtient des résultats sans différence significative avec les autres mutants t2, t3 et t4. Concluez.
4.Parmi ces 4 980 colonies, 4 836 se révèlent [ilv+, met–], 69 sont [ilv+, met+], 73 sont [ilv–, met–] et 2 sont [ilv–, met+]. Donnez la disposition des gènes entre eux sans faire de calculs mais en détaillant le génotype du diploïde dont sont issues les spores étudiées.
5.À partir des croisements précédents t3 × B et t4 × B, on a pu isoler des spores de phénotype [met–, trp–, ilv+] qui sont respectivement nommées t3′ et t4′. Précisez leur génotype.
On croise chaque mutant t1 et t2 avec chaque mutant t3′ et t4′; les diploïdes sont mis à sporuler et on étale environ 10 000 spores issues de chacun des croisements sur des boîtes de milieu Mo additionné de méthio-nine, de valine et d’isoleucine. Par réplique on teste les colonies alors obte-nues pour les phénotypes [ilv] ou [met]. Interprétez les résultats (tabl. 6.4).
➤ Niveau Licence/Définition des objectifs.
– Cartographie de gènes chez la levure Saccharomyces cerevisiae par test trois points.
– Carte fine des sites par test quatre points.
Solution
1.Les diploïdes du croisement A × B donnent 50 % de spores [ilv+] et 50 % de spores [ilv–], le mutant A diffère de B pour un seul des gènes impliqué dans la fraction commune des chaînes de biosynthèse de l’isoleucine et de la valine. De même la ségrégation 2/2 pour le phénotype méthionine permet de conclure que B est un mutant simple.
En revanche, les deux gènes mutés chez A et B sont génétiquement liés puisque la méiose laisse apparaître des fréquences de spores recombinées sauvages ou double mutantes très inférieures à celles des gamètes parentaux. La fréquence des spores recombinées est égale à 260/9 000 = 0,0288; la distance entre les deux gènes (plus exactement les deux sites de chacun des deux gènes) est égale à 2,88 ur.
2.Les quatre mutants ont un phénotype [trp–] récessif, ce qui permet de conclure qu’il n’y a pas de complémentation fonctionnelle chez les diploïdes issus des croisements de mutants entre eux, et que ces mutants sont mutés au moins dans un même gène (le même gène s’ils ne sont mutés que dans un seul gène).
3.Toutes les spores peuvent pousser sur le milieu d’étalement, quel que soit leur phénotype, mais seules les spores [trp+] peuvent pousser sur le milieu de réplique qui sert à tester la ségrégation pour le seul phénotype tryptophane. Il y a ségrégation 2/2 pour les quatre mutants qui sont donc mutés dans le même gène, mais sans doute pas au même site, puisque ce sont des mutants indépendants.
4.Si le gène impliqué dans le phénotype tryptophane, noté t, était génétiquement indépen-dant des deux gènes (très liés entre eux) impliqués dans les phénotypes ilv et met, notés i etm, le génotype du diploïde pourrait s’écrire :
TABLEAU 6.4 EFFECTIFSDESCOLONIESCAPABLESDEPOUSSERSURCHACUNDESMILIEUX DERÉPLIQUEÀPARTIRDEBOÎTESMÈRESCONTENANT 10 000 COLONIES ISSUESDESSPORESOBTENUESÀPARTIRDESQUATRECROISEMENTSANALYSÉS.
Croisements analysés
Nombre de colonies sur Mo +val +ile +met
Nombre de colonies
[ilv+, met+]
Nombre de colonies [ilv–, met–]
spores issues de t1 × t3′ 8 7 0
spores issues de t1 × t4′ 4 0 4
spores issues de t2 × t3′ 16 15 0
spores issues de t2 × t4′ 5 5 0
i –
i+
m+
m– t –
t+
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
On devrait alors avoir égalité des phénotypes parentaux [ilv–, met+] et [ilv+, met–] parmi les spores de phénotypes [trp+], ce qui n’est pas le cas (2 contre 4 836 !); le gène t est donc lié aux deux autres et le génotype du diploïde peut s’écrire de trois façons différentes puisqu’on ne sait pas lequel des trois gènes est central (fig. 6.3).
Parmi les spores de phénotype [trp+], les spores [ilv–, met+] sont minoritaires, ce qui signifie que l’ordre des gènes est tel que les spores les plus rares sont les spores de génotype (t+, i–, m+).
Si la première cartographie correspond à la réalité, les spores de génotype (t+, i–, m+), étant issues d’un crossing-over entre les gènes t et i, seront plus fréquentes que les spores (t+, i–, m–) nécessitant deux crossing-over. Les observations étant non conformes aux résultats attendus sous cette cartographie, celle-ci doit être rejetée.
Si la troisième cartographie correspond à la réalité, les spores de génotype (t+, i–, m+), étant issues d’un crossing-over entre les gènes t et m, seront plus fréquentes que les spores (t+, i+, m+) nécessitant deux crossing-over. Les observations étant non conformes aux résultats attendus sous cette cartographie, celle-ci doit être rejetée.
Si la deuxième cartographie correspond à la réalité, les spores de génotype (t+, i–, m+), étant issues de deux crossing-over, entre les gènes t et i, et entre les gènes t et m, seront plus rares que tous les autres types de spores recombinées ne nécessitant qu’un seul crossing-over. Les observations étant conformes aux résultats attendus sous cette cartographie, celle-ci peut être acceptée, le gène t est central.
5.Chaque diploïde est porteur de deux exemplaires mutés du gène t, schématisé par un rectangle, mais à des sites différents. Le diploïde pourra être schématisé de deux façons possibles (fig. 6.4), selon la disposition respective des sites t1– et t3– par rapport aux deux gènes i et m.
La figure 6.4 ne laisse figurer que l’échange chromatidique conduisant à une spore de phéno-type [trp+], ce qui permet bien de voir que, selon la disposition des sites t1 et t3, cette spore
t– Figure 6.3 bis Disposition des 3 gènes, selon trois ordres possibles.
i – t1– t3+ m+
i + t1+ t3– m–
i– t3+ t1– m+
i+ t3– t1+ m–
Figure 6.4 Disposition relative des sites mutés du gène t par rapport aux gènes i et m.
Les notations t1–, t1+, t3– et t3+ se rapportent à la nature mutée ou sauvage de la séquence nucléotidique en ce site précis du gène, celui-ci étant de toute façon non fonctionnel quel que soit le site muté. On a figuré l’échange chromatidique permet-tant de reconstituer une séquence sauvage fonctionnelle pour le gène t.
sauvage sera le plus souvent, à moins d’un autre crossing-over, possible mais rare, [ilv+, met+] si la cartographie correspond à la première hypothèse, et [ilv–, met–] dans l’autre cas.
Des données du tableau 6.4, on peut conclure que les sites t1 et t3 correspondent au premier type de cartographie. L’ordre est ainsi i-t1-t3-m. Pour t1 et t4, on obtient, l’ordre i-t4-t1-m, d’où on peut conclure à l’ordonnancement i-t4-t1-t3-m. L’analyse des autres données permet de conclure à la cartographie i-[t2, t4, t1, t3]-m.
Exercice 6.4
Des études génétiques ont montré que trois des gènes de levure, impliqués dans la métabolisation du galactose sont contigus. Ils sont respectivement nommés GAL7, GAL10 (central) et GAL1.
On a isolé, par irradiations aux rayons X, trois mutants [gal–], nommés d1, d2 et d3, dont on peut suspecter qu’ils sont porteurs d’une délétion, d’une part en raison du mutagène utilisé, mais aussi parce qu’ils ne donnent aucun révertant (chap. 7), enfin parce que le diploïde issu du croisement avec sauvage donne une stricte ségrégation 2/2 (50 % de spores [gal+] et 50 % de spores [gal–]) alors que ces mutants appartiennent simultanément à deux groupes de complémentation entre lesquels il est assez facile d’avoir des recombinaisons pour les mutants simples.
1.On croise les mutants d avec des mutants ponctuels simples touchés respectivement dans l’un des trois gènes et désignés par m7, m10 et m1, et on teste la capacité des diploïdes de pousser sur galactose. Interprétez les résultats (tabl. 6.5).
2.Quatre mutants ponctuels de GAL7, nommés m7-1, m7-2, m7-3 et m7-4 sont croisés soit avec le mutant d1, soit avec d3. On met les diploïdes ainsi obtenus à sporuler afin de recueillir un très grand nombre de spores qu’on étale sur un milieu ne contenant que du galactose comme source de carbone. Interprétez les résultats (tabl. 6.6).
Par ailleurs, les diploïdes issus des croisements entre le mutant ponctuel m10-5 et le mutant d1 ou le mutant d2 sont capables de donner des spores [gal+]. Concluez.
TABLEAU 6.5 PHÉNOTYPEGALDESDIPLOÏDESISSUSDESCROISEMENTS ENTREMUTANTSPONCTUELSETMUTANTSPARDÉLÉTION.
«+»désigne la capacité de croissance sur galactose.
m7 m10 m1
d1 – – +
d2 + – –
d3 – – –
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
➤ Niveau Licence/Définition des objectifs.
– Cartographie par délétion pour ordonner des sites ponctuels et préciser l’ampli-tude des délétions.
– Distinguer le test fonctionnel et le test de recombinaison.
Solution
1.Il s’agit ici, par un test fonctionnel, de dénombrer les gènes « couverts » par la délétion;
l’analyse du tableau conduit au schéma suivant, où les cadres indiquent les étendues
l’analyse du tableau conduit au schéma suivant, où les cadres indiquent les étendues