L'adénylcyclase AC de CyaA est divisée en deux segments, le segment N-terminal T25 (résidus 1-224) et le segment C-terminal T18 (résidus 225-399) [134]. Les deux segments sont impliqués dans la liaison avec la CaM mais T18 est le segment qui forme le plus de contacts. Le site catalytique se situe entre T18 et T25 [138]. Chaque segment porte un résidu tryptophane, W242 étant situé dans le segment T18 et W69 dans le segment T25.
Des études précédentes ont montré que le c÷ur du site de liaison de AC à la CaM est situé autour du résidu tryptophane 242 [44; 142; 143; 144]. Ainsi, les premières expériences de mutagénèse dirigée se concentraient sur le résidu W242.
Mutations de résidus dans la région de contact avec la CaM.
Glaser et al. (1989) [135] ont construit les quatre mutants W242V, W242R, W242G, W242D. En eet, W242 se situe au milieu de l'hélice α H, et les résidus aspartate et glycine ont tendance à destructurer les hélices, contrairement aux résidus tryptophane et valine. De plus, Cox et al (1985) [145] avaient déjà suggéré qu'une hélice α est l'élément d'interaction avec la CaM essentiel des adénylcyclases bactériennes et d'autres protéines interagissant avec elle, chose qui a été con rmée par de nombreuses études des interactions peptide-CaM [111; 117]. Et la séquence autour du résidu W242 a des caractéristiques communes aux peptides liant la calmoduline, comme par exemple la présence de résidus basiques et hydrophobes formant une
hélice α amphiphilique [146; 135]. Glaser et al. ont démontré que ces quatre mutants expriment des activités considérablement diérentes à une concentration de CaM qui est saturante pour l'enzyme sauvage (10 nM). Le mutant W242V est le moins aecté, comme attendu, il conserve 90% de l'activité maximale du WT. Les mutants W242D et W242G sont les plus aectés dans leur activation par la CaM et dans leur activité. Le mutant W242D, le plus aecté, ne présente que 6.6% de l'activité normale, et requiert 350 nM de CaM pour être activé contre 0.20 nM pour le wild-type. Le mutant W242G a une sensibilité pour la CaM réduite d'un facteur 1000. En revanche, l'a nité pour l'ATP n'a changé pour aucun des quatre mutants.
Guo et al. (2005) [131] ont construit également le mutant W242G a n d'étudier les eets des lobes N-CaM et C-CaM séparemment sur l'activité de AC. Il en résulte que le mutant a une sensibilité réduite aussi bien pour la C-CaM que pour la N-CaM, ce qui suggère que CyaA peut interagir aussi bien avec N- ou C-CaM pour former des complexes hétérogènes. D'autre part, le mutant W242G a une activation par la CaM drastiquement réduite [135].
Le mutant W242V fut également étudié par Gilles et al. [142] et Bouhss et al [132].
Guo et al. ont pu dé nir, grâce à la structure cristallographique du complexe AC/C-CaM qu'ils ont résolue, d'autres régions étant en contact avec la C-CaM : l'hélice F (H197R206), l'hélice H (R235R246) et l'hélice H'avec la boucle qui la précède (R250R259), la queue C-terminale (E346R360). Ces régions sont en accord avec le fait que le segment P196 à M267 contribue à environ 90% de l'énergie de liaison à la CaM [132].
Ces auteurs ont donc construit des mutants indépendants qui contiennent des mutations au niveau de résidus compris dans ces régions. Ainsi, ils ont démontré que le mutant R206A (hélice F) adopte un comportement comparable à celui de AC sauvage, et que les trois autres mutants W242G (hélice H), R258A/R259A (Hélice H') et E346A/R348A (C-ter) ont une activation par la CaM réduite en présence de calcium. Par conséquent, leur e cacité catalytique est également réduite (kcat/Km), ainsi que leur a nité pour la CaM, bien que cela soit moins apparent à des concentrations de Ca2+ élevées.
Mutations dans le site catalytique.
Avant la détermination de structure de AC, il avait été remarqué [44] que le domaine T25 isolé présentait une activité enzymatique faible mais détectable, ce qui indiquait qu'il est porteur du site catalytique. Très tôt, des études de mutagenèse dirigée ont donc ciblé des résidus de cette région.
Les premiers mutants de cette région, K58Q et K65Q, ont été construits par Glaser et al. (1989) [135], car le site de liaison à l'ATP était supposé être localisé autour de ces résidus. L'activité catalytique de ces deux mutants a été drastiquement réduite pour des conditions de CaM saturante, comparé à l'activité de AC sauvage. En eet, K65Q (la plus active des deux) a une activité de 1.4 µmol/min.mg de protéine contre 2540 µmol/min.mg de protéines pour AC sauvage. Les propriétés de leur liaison à la CaM n'ont pas été modi ées.
T18 est le segment majeur de liaison à la calmoduline, mais les deux fragments sont nécessaires pour restaurer une activation par la CaM et une activité catalytique normale [134; 143]. Bouhss et al. (1993) [132] ont démontré que l'intersection entre les segments T18 et T25 d'une longueur de 72 acides aminés, est responsable de 90% de l'énergie de liaison du complexe AC/CaM, grâce aux mutants [132] : R235E, L241E, K243E, W242V (tous localisés dans l'hélice H), R221Q, R223Q, R224E (tous situés dans l'hélice G), R164E, R165E, K166E, W69V, P184W (CB). De plus, ces auteurs ont démontré que la catalyse et la liaison de la CaM sont dramatiquement altérées, et que le résidu W69 est important pour la stabilisation de la structure tertiaire de la protéine via des interactions de Van der Waals.
Bouhss et al. ont également construit le mutant W69F (CB) en 1996 [147], qui ne conserve que 40 % de l'activité de AC sauvage, et qui perd 9 % d'énergie de liaison à CaM.
D'autre part, sur les neuf résidus histidine localisées au niveau du site catalytique de Bordetella pertussis, trois (H63, H106 et H298) sont conservés dans l'adénylcyclase de Bordetella anthracis. Une série de mutations sur deux de ces trois histidines a été réalisée par Munier et al. (1992) [148] : H63Q, H63R, H63E, H63V, H106R, H106Q, H106N. Ces modi cations de AC ont conduit à une diminution de l'activité catalytique, montrant ainsi l'importance de ces deux histidines pour une activité catalytique e cace. Cependant, la mutation du résidu H63 se révèle la plus critique, avec une perte d'activité d'un facteur 2000 à 3000, tandis que l'a nité pour la CaM n'est pas altérée.
Mutations de résidus de AC susceptibles de lier N-CaM
Récemment, Guo et al. ont prédit la position du lobe N-CaM par des expériences d'amarrage protéine-protéine (Docking) et de simulations de dynamique moléculaire, et ont testé leurs hy-pothèses par des expériences de mutagenèse dirigée, de pontage (cross-linking) et de transfert d'énergie entre molécules uorescentes (FRET) [102].
Leur modèle les conduisit à supposer que les résidus acides de N-CaM forment des ponts salins avec les résidus basiques de AC R223, R224 et R235. D'après ce modèle, la mutation de ces trois résidus en alanine devrait aecter l'activation de AC par la CaM, mais pas par la C-CaM. Les tests furent négatifs, suggérant que N-CaM ne se lie pas à l'hélice G.
Une interaction entre l'épingle à cheveux β derrière l'hélice H a également été envisagée. Les mutants E256A, Q260A, R262A ont une sensibilité d'activation par la CaM réduite mais pas par la C-CaM, ce qui suggère que N-CaM se lie bien à cette région.
D'autre part, le domaine hélicoïdal C-terminal du facteur ÷démateux (Bordetella anthracis) fait des contacts extensifs avec N-CaM et cette interaction sert à ancrer la CaM pour induire un changement conformationnel de cette toxine. Guo et al. ont émis l'hypothèse que le domaine C-terminal de AC (résidus 361 à 373) pourrait lier N-CaM. Deux mutants ayant la région 361-366 pour l'un et 367-372 pour l'autre tronquée ont été construits. La délétion de la région 361-366 montre une réduction de 50% de la sensibilité d'activation de l'activité catalytique de CyaA
par la CaM, contrairement à la région 367-372. En revanche, cette délétion n'a pas aecté la sensibilité d'activation par la C-CaM, qui est, comme attendue, environ 30 fois plus faible que CaM.
Dans d'autres modèles, l'épingle à cheveux β (résidus 255-264) ainsi que les résidus Q260 et R262 et/ou E256 interagissent avec CaM [102]. Des mutations au niveau des résidus de N-CaM qui interagissent avec ces régions con rme cette observation. Mais pour évaluer davantage ce modèle et estimer la proximité des résidus appariés, des expériences de cross-linking ont été réalisées en mutant les résidus A257, Q260, T263 de AC et Q41 et D50 de N-CaM en cystéine, dans l'optique de former des ponts disulfures. Cette expérience est rendue possible du fait que ni AC ni CaM ne possède de cystéine. Un pont disulfure a été observé entre les résidus Q260C de AC et D50C de CaM.
Cette même expérience reproduite en mutant les résidus A94 et A225 situés à l'extrémité opposée de CyaA et les résidus Q41 et T26 de CaM en cystéine n'a eu qu'un eet minimal sur l'activation de CyaA par la CaM.
3 Plan de l'étude
Les interactions entre bio-molécules régulent la plupart des mécanismes biologiques au sein de la cellule, tels la transduction du signal, la croissance, la diérenciation et bien d'autres encore, comme il l'a été décrit au cours de ce premier chapitre. Beaucoup d'interactions protéine-protéine impliquées dans la signalisation cellulaire sont associées à des maladies spéci ques, dont les maladies immunitaires ou infectieuses. Dans le cadre des recherches thérapeutiques, les interac-tions protéine-protéine constituent de nouvelles cibles privilégiées pour la recherche de composés bioactifs agissant à leur interface, ou au niveau de sites allostériques. L'étude de ces interactions représente donc un enjeu majeur.
L'activation d'une protéine par son partenaire implique des changements conformationnels importants pour propager cette information. La exibilité d'une protéine joue également un rôle essentiel dans son activation enzymatique. Une étude précédente sur le facteur oedemateux EF de Bacillus anthracis [149], responsable de la maladie de l'anthrax, a été menée a n de comprendre comment sa grande mobilité structurale et son interaction avec la calmoduline, protéine d'une exibilité remarquable, joue un rôle crucial dans l'établissement de sa fonction enzymatique. Ces travaux ont orienté le choix de l'objet d'étude de cette thèse sur l'étude du complexe AC/CaM, qui possède 25% d'identité de séquence avec le complexe EF/CaM, mais qui est structuralement homologue à ce dernier. Cependant, les interactions sont diérentes, à cause de l'absence d'un domaine hélicoïdal dans AC/CaM. D'autre part, CyaA est une protéine étudiée depuis plus de trente ans et bien connue des expérimentalistes de l'Institut. Cette thèse étant majoritairement portée sur des simulations de dynamique moléculaire, il est donc plus aisé de comparer les
résultats avec ceux de la littérature déjà très vaste, ainsi que de les valider par de nouvelles expériences au sein de l'Institut.
Cette thèse comporte trois parties. La première partie consiste en l'étude de la dynamique interne du domaine catalytique AC de l'adénylcyclase, et de la stabilisation de celui-ci par le lobe C-terminal de la calmoduline (C-CaM). L'in uence de ce dernier, ainsi que des ions calcium sur la stabilité du complexe a été analysée à travers l'étude de la plasticité des deux partenaires, réalisée par dynamique moléculaire. Dans ce même chapitre, les aspects énergétiques de ces in uences sur l'interaction AC-CaM ont également été caractérisés, et a permis l'identi cation d'un réseau d'interactions entre ces deux partenaires. Ainsi, des résidus clés ont été mis en évidence, pouvant être mis en relation avec la fonction enzymatique. Le rôle que jouent ces résidus clés sur le contrôle allostérique de l'activation de AC a été analysé dans le chapitre V, par des simulations de dyna-mique moléculaire classique incluant des mutations au niveau de ces résidus, mais également par des expériences de mutagenèse dirigée, que j'ai réalisées dans l'unité de Biochimie des interactions macromoléculaires de l'Institut Pasteur, dirigée par Daniel Ladant. Ces expériences ont permis de mettre en évidence une région intermédiaire clé, formée par ces résidus, qui assure la transmission de l'information de transition conformationnelle entre C-CaM et le site catalytique de AC. La dernière partie de cette thèse est consacrée à la prédiction d'une structure du domaine AC isolé se rapprochant des descriptions expérimentales connues. En eet, aucune structure tridimensionnelle à haute résolution de AC n'a été résolue, mais des mesures hydrodynamiques attestent qu'il se présente sous une forme compacte. Les simulations de dynamique moléculaire classique réalisées dans le premier chapitre n'ont pas permis d'observer une telle transition. Une approche récente et originale, appelée Dynamique moléculaire accélérée par la température (Temperature Accelerated Molecular Dynamic (TAMD)) [150], a donc été utilisée pour accélérer la dynamique moléculaire du domaine AC, dans le but de franchir les barrières énergétiques qui séparent les diérents états de AC, et prédire ainsi une structure stable de AC à l'état non-lié.
Présentation de quelques méthodes
d'exploration de l'espace conformationel
des protéines par des simulations de
dynamique moléculaire
1 La dynamique moléculaire
La dynamique moléculaire consiste à étudier, par le calcul numérique, l'évolution d'une molécule au cours du temps. Conçue à l'origine dans le cadre de la physique théorique, elle s'est maintenant étendue aux domaines des sciences des matériaux et des biomolécules. Elle permet ainsi d'explo-rer l'espace conformationnel d'une protéine à partir de sa structure, dont les coordonnées ont été résolues par des méthodes de biologie structurale (cristallographie aux rayons X, résonance ma-gnétique nucléaire (RMN)), dans le but de comprendre la relation structure-dynamique-fonction, ou de déterminer des conformations inaccessibles par ces méthodes.