Analyse de l'interaction C-CaM/AC au cours des trajectoires de DM

Dans cette section, trois simulations de dynamique moléculaire indépendantes ont été réalisées sur le complexe formé entre la C-CaM et AC modié de trois façons diérentes. Dans le premier système, ACm3A(2Ca-C-CaM), trois résidus de AC, ARG338, ASN347 et ASP360 (gure V.1 A et B) ont été modiés en alanine. Le second, ACm2A(2Ca-C-CaM), ne contient que les deux

Résidus liés par Pourcentage Code Région

un pont d'eau de formation PDB de AC

GLU-340-N/GLN-336-O 25.0 1YRT Cter/CA

TYR-342-OH/ASN-35-OD1 50.0 1YRT,1YRU Cter/CA

TYR-342-N/ARG-338-O 75.0 1YRT,1ZOT,2COL Cter/CA

TYR-345-N/ILE-194-O 75.0 1YRT,1ZOT,2COL Cter/SA

Tab. V: Ponts d' eau observés pour les résidus de la boucle Lα16Cter dans les entrées PDB 1YRT, 1YRU, 1ZOT et 2COL.

modications ARG338ALA et ASP360ALA (gure V.1 A). Le dernier, ACm1A(2Ca-C-CaM), ne porte que la mutation ASN347ALA gure(V.1B). La simulation de ces variants a pour objectif de vérier leur stabilité, et d'analyser les variations d'interaction au niveau de l'interface C-CaM/AC. La dérive conformationnelle du complexe AC/C-CaM a été calculée pour les trajectoires ACm1A(2Ca-C-CaM), ACm2A(2Ca-C-CaM) et ACm3A(2Ca-C-CaM) (Figure IV.2a). Elle est globalement similaire pour les trois protéines modiées, et atteint rapidement un plateau de 3 Å. De plus, le plateau du RMSD est similaire à celui obtenu pour les trajectoires de DM sur le complexe AC/C-CaM dont AC sauvage (Chapitre IV, simulations AC(2Ca-C-CaM) et AC (0Ca-C-CaM)) et qui restaient stables au cours de la simulation. Ces résultats nous permettent de dire que les mutations ne déstabilisent pas la structure du complexe déjà formé, au moins aux échelles de temps considérées dans les simulations.

La dérive conformationnelle a également été calculée sur chaque région de AC des trois tra-jectoires des protéines modiées (Figure V.3b-d). Pour ACm1A(2Ca-C-CaM) (Figure V.3b) et ACm3A(2Ca-C-CaM) (Figure V.3d), la dérive conformationnelle de chaque région est inférieure à 4 Å, ce qui indique une stabilité de ces régions dans le complexe. Les plus grandes valeurs de RMSD sont observées pour toutes les régions sauf CB. Cette observation est en accord avec le fait que les mutations introduites sont localisées dans le voisinage des régions CA, SA, C-loop et C-ter. Le grand RMSD observé pour SA est analogue à ce qui avait été observé dans la dynamique AC(2Ca-C-CaM) (Chapitre IV, Figure IV.2).

Pour ACm2A(2Ca-C-CaM) (Figure V.3c), le RMSD de la région CA, qui contient l'extrémité C-terminale et la boucle catalytique, est légèrement plus élevé que dans ACm1A et ACm3A avec un plateau à 4 Å. De plus, le RMSD obtenu pour l'extrémité C-terminale est beaucoup plus élevé avec un plateau à 6 Å. Par contre, dans les trois trajectoires des protéines modiées, le RMSD de la boucle catalytique reste stable autour de 2 Å. Une observation plus précise de la gure V.3c montre que les dérives conformationnelles de CA et de l'extrémité C- terminale sont parallèles, et que l'extrémité C-terminale est donc majoritairement responsable de la perturbation de CA. L'une des deux mutations introduites dans ACm2A est située au niveau de l'interface C-CaM/C-ter. L'extrémité C-terminale subit donc une réorganisation conformationnelle due à l'introduction de cette mutation, mais cette réorganisation reste limitée à cette région et ne se propage pas au reste de la protéine.

0 2 4 6 8 RMSD ( A °) a) 0 2 4 6 8 RMSD A Cm1A ( A °) b) 0 2 4 6 8 RMSD A Cm2A ( A °) c) 0 2 4 6 8 RMSD A Cm3A ( A °) 0 10 20 30 40 50 d) _C−Loop SA Hom loop Hélice H' Hélice H Hélice G Hélice F C−ter CB CA AC Temps (ns)

Fig. V.3: Dérives conformationnelles estimées par le calcul du RMSD des coordonnées atomiques des carbones α. La conformation de référence est la première de chaque trajectoire. (a) Dérives calculées sur le domaine AC des trajectoires ACm1A(2Ca-C-CaM) (courbe noire), ACm2A(2Ca-C-CaM) (courbe verte) et ACm3A(2Ca-C-CaM) (courbe rouge). (b-d) Dérives calculées sur les diérentes régions du domaine AC pour les trajectoires ACm1A(2Ca-C-CaM) (b) ACm2A(2Ca-C-CaM) (c) et ACm3A(2Ca-C-CaM) (d). Les courbes sont colorées en fonction de la région selon la légende de la gure (d). Les régions de AC sont dénies de cette façon : CA comprend les résidus 7-61, 187-197, 261-299 and 313-345 for CA, la boucle catalytique comprend les résidus 300-312, la queue C-terminale contient les résidus 346-364, CB est composée des résidus 62-186 et SA des résidus 198-260. Les hélices H, F, G, H' correspondent aux résidus 234-253, 198-210, 214-223, 256-260.

atomiques (Figure V.4) montre des caractéristiques similaires à celles observées sur les trajectoires du complexe où AC est non muté. En eet, les extrémités SA et CB sont celles qui bougent le plus avec une tendance à se rapprocher l'une de l'autre, tandis que CA et C-CaM sont les moins mobiles. Les trois mutations produisent des projections similaires du premier vecteur propre, la seule diérence étant un mouvement de la queue C-terminale plus large dans ACm2A, ce qui est en accord avec la dérive conformationnelle de cette région décrite dans le paragraphe précédent.

Dans le but d'obtenir des informations plus précises sur l'interaction entre C-CaM et AC mo-dié, les liaisons hydrogène établies entre ces deux protéines ont été étudiées. Une analyse globale a d'abord été faite sur le nombre de liaisons hydrogène établies entre C-CaM et les diérentes ré-gions de AC modié dans plus de 50% de la trajectoire (Tableau VI). Parmi les trois trajectoires des variants de AC, ACm3A(2Ca-C-CaM) est celui qui décrit le moins de liaisons hydrogène

ACm2A

ACm3A

ACm1A

Fig. V.4: Analyse en Composantes Principales de la matrice de covariance de la dynamique in-terne des mutants calculée sur les trajectoires ACm1A(2Ca-C-CaM), ACm2A(2Ca-C-CaM) et ACm3A(2Ca-C-CaM). (a) Distribution des valeurs propres colorées en violet pour ACm1A(2Ca-C-CaM), en orange pour ACm2A(2Ca-C-CaM) et en vers pour ACm3A(2Ca-C-CaM). Projection sur le premier mode du système ACm1A(2Ca-C-CaM) (b), du système ACm2A(2Ca-C-CaM) (c), du système ACm3A(2Ca-C-CaM) (d). Les régions du complexe sont colorées en rouge (C-CaM), violet (SA), vert (CA), orange (CB), cyan (C-ter) et jaune (C-loop).

entre C-CaM et l'extrémité C-terminale, ACm1A(2Ca-C-CaM) étant celui qui en montre le plus. Cependant, dans toutes les trajectoires sauvages (AC(2Ca-C-CaM) et AC(0Ca-C-CaM)) pro-duites en présence ou en absence d'ions Ca2+, plus de huit liaisons hydrogène sont observées entre C-CaM et l'extrémité C-terminale, ce qui représente au moins le double de ce qui a été observé pour ACm3A(2Ca-C-CaM).

Trajectoire C-CaM/Cter C-CaM/CA C-CaM/SA

ACm1A(2Ca-C-CaM) 14 4 23 ACm2A(2Ca-C-CaM) 8 3 23 ACm3A(2Ca-C-CaM) 4 2 23 ACWT(2Ca-C-CaM) 8 4 19 ACWT(0Ca-C-CaM) 9 2 22 ACWTbis(2Ca-C-CaM) 8 3 15 ACWTbis(0Ca-C-CaM) 10 5 16

Tab. VI: Nombre de liaisons hydrogène présentes entre C-CaM et AC à plus de 50 % du temps des trajectoires. Les liaisons hydrogène sont classées selon la région où les résidus de AC sont situés : C-CaM/Cter représente les liaisons hydrogène entre C-CaM et l'extrémité C-terminale, C-CaM/CA représente les liaisons hy-drogène entre C-CaM et la région CA exclusivement (sans l'extrémité C-terminale), C-CaM/SA représente les liaisons hydrogène entre C-CaM et SA. CA comprend les résidus 7-61, 187-197, 261-299 and 313-345, l'extrémité C-termimale contient les résidus 346-364, SA comprend les résidus 198-260.

Les liaisons hydrogène entre C-CaM et AC ont ensuite été analysées plus en détail en sélec-tionnant les liaisons hydrogène établies à plus de 80% du temps pour au moins une des simulations (Annexe A.1). En regardant plus en détail les liaisons hydrogène formées entre C-CaM et AC, quelques groupes de résidus ont été extraits (Figure V.5).

Fig. V.5: (A). Vue générale de l'interface entre C-CaM et AC. Les résidus impliqués dans une liaison hydrogène formée dans plus de 80% d'une trajectoire donnée, sont représentés en bâtons. (B-E). Zooms sur dié-rentes parties de l'interface, avec les mêmes résidus représentés en bâtons. (B) Interface C-CaM/CA. (C) Interface C-CaM/Cter. (D) Interface C-CaM/SA1. (E) Interface C-CaM/SA2. Pour (D) et (E), les noms des hélices sont soulignés. Les résidus ARG-237 et TRP-242 appartiennent à l'hélice H. SA1 comprend l'hélice H' de SA, tandis que SA2 contient des fragments des hélices H, F et G.

Le premier groupe (Figure V.5B) inclut les résidus ARG-90a, ASP-93a, HIS-107a, ASN-111a des deux côtés de la première main EF de C-CaM, et les résidus ARG-338, GLU-339 et PHE-344 de CA. Le résidu ARG-338 a été muté en alanine dans ACm2A et ACm3A. Ce groupe montre également une variation dans les liaisons hydrogène établies parmi les trajectoires de AC sauvage (WT) et des variants de AC, ainsi qu'entre AC sauvage et les variants (Annexe A.2).

Le second groupe (Figure V.5C), inclus les résidus ARG-86a, GLU-87a et ARG-90a de la première hélice α de C-CaM qui interagissent avec les résidus ASP-360, GLU-346 et ARG-348 de l'extrémité C-terminale. Le résidu ARG-360 a été modié en ALA dans ACm2A et ACm3A. Le nombre de liaisons hydrogène varie de manière assez importante entre les diérentes trajectoires. Le nombre de liaisons hydrogène présentes dans plus de 80% de la trajectoire est compris entre 5 et 7 sur l'ensemble des trajectoires, à l'exception de ACm3A. Dans ACm3A, seule la liaison hydrogène ARG-90a-2HH2/GLU-346-OE1 est présente à plus de 80% du temps.

Le troisième groupe (Figure V.5D) contient les résidus ASP-80a, GLU-84a, GLU-87a et l'extrémité N-terminale de C-CaM, et les résidus ARG-258, ARG-259 de l'hélice α H' de la région SA. Les liaisons hydrogène entre GLU-84a et ARG-259 sont présentes dans toutes les trajectoires, et ancrent l'extrémité N-terminale de C-CaM à l'hélice α H'.

MET-124a situés sur la boucle qui connecte les deux mains EF de C-CaM, aux résidus 202, ARG-206 (hélice α F de SA), VAL-215 (hélice α G de SA), et ARG-237, TRP-242 (hélice α H de SA). La liaison hydrogène MET-124a-O/TRP-242-HE1 est présente dans toutes les trajectoires avec des pourcentages de formation toujours supérieurs à 99%. Cette stabilité de la liaison hydrogène est en accord avec les observations faites par Vougier [136] que la mutation de Met-124a dans CaM détériore fortement son interaction avec AC.