Caractéristiques du modèle Tie2-GFP et mise en évidence de l’EndoMT

La stratégie mise en place pour identifier l’EndoMT in vivo s’est basée sur l’utilisation de souris exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur endothélial spécifique Tie2 (Motoike et al. 2000). Ainsi, il a été possible de suivre le changement phénotypique des cellules endothéliales vers un phénotype mésenchymateux-like (co-marquage de la GFP et de l’α-SMA) après une irradiation colorectale.

En conditions physiologiques, le système Tie fait intervenir deux récepteurs de type tyrosine kinase, Tie1 et Tie2, qui après fixation de leurs ligands, les angiopoiétines, participent à la régulation de l’angiogenèse et au maintien de l’homéostasie endothéliale (Jones et al. 2001). L’expression de Tie1 et Tie2 est détectée de manière précoce au niveau de l’endocarde au cours du développement embryonnaire chez la souris (8ème jour embryonnaire) et cette expression est également observée dans les cellules endothéliales vasculaires matures (Sato et al. 1993; Schnurch et al. 1993). De fait, ces gènes sont identifiés comme étant des marqueurs endothéliaux stables. A ce propos, le suivi de l’expression de Tie2 a permis de confirmer l’existence de l’EndoMT dans un contexte physiologique au niveau des valves cardiaques chez la souris (Kisanuki et al. 2001), et également dans des contextes de fibrose tissulaire et dans la démonstration de l’origine endothéliale des CAF (Zeisberg et al. 2007a; Zeisberg et al. 2008). L’ensemble de ces résultats vient donc appuyer l’intérêt de ce modèle et la pertinence de son utilisation dans la mise en évidence de l’EndoMT radio-induite. Nos résultats ont permis de révéler pour la première fois l’existence de l’EndoMT dans un modèle pré-clinique de rectite radique.

L’EndoMT étant caractérisée par l’acquisition d’un phénotype migratoire in vitro, nous avons par la suite analysé la localisation des cellules en transition dans notre modèle de rectite radique. De manière intéressante, aucune cellule en EndoMT n’a été observée en dehors des vaisseaux contrairement à d’autres modèles de fibrose rénale, pulmonaire et intestinale (Hashimoto et al. 2010;Rieder et al. 2011; LeBleu et al. 2013). Ceci suggère que l’expression de Tie2 pourrait diminuer au fur et à mesure que les cellules endothéliales se transdifférencient et migrent dans le tissu, et que la faible intensité du marquage GFP soit masquée par l’intensité du marquage α-SMA. Nous avons donc effectué un marquage de la GFP seule dans les tissus les plus lésés et fibrosés. Nos résultats ont pu révéler la présence de

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166 cellules allongées GFP positives présentes dans le tissu conjonctif suggérant la présence de cellules mésenchymateuses d’origine endothéliale pouvant prendre part au développement de la fibrose digestive radio-induite. La synthèse des connaissances actuelles permet donc de considérer le modèle Tie2-GFP comme une valeur sûre dans l’étude du suivi du phénotype endothélial. De plus, ce modèle est couramment utilisé pour identifier l’EndoMT in vivo. Néanmoins, l’existence de limites concernant l’expression du promoteur Tie2 est à prendre en considération.

La spécificité du promoteur Tie2 a en effet été remise en cause suite à la mise en évidence de son expression par d’autres types cellulaires. De Palma et al ont notamment pu montrer que l’expression de Tie2 caractérise trois populations cellulaires distinctes, à savoir les cellules hématopoïétiques et myéloïdes/monocytaires (CD45+ CD11b+ CD19-), les précurseurs des péricytes et certains leucocytes, dans un contexte d’angiogenèse pro-tumorale (De Palma et al. 2003; De Palma et al. 2005). De plus, nous avons observé la présence de cellules GFP+ de petite taille, rondes, en grand nombre au sein de l’infiltrat et impossible à discriminer des CE des microvaisseaux. Ces cellules GFP⁺ pourraient correspondre à ces progéniteurs. Nous avons donc mis en place une stratégie d’extinction de la GFP dans la moelle osseuse, afin de supprimer les progéniteurs hématopoïétiques GFP⁺ provenant de la moelle, dans le tissu irradié. Pour cela, les souris Tie2-GFP ont été exposées à une dose de 9,5 Gy TBI afin de dépléter la moelle, puis ont reçu une greffe de moelle provenant de souris B6 (GFP-) (Figure 35). Les résultats obtenus ont permis de montrer que l’extinction de la moelle n’a pas d’influence sur le nombre de cellules GFP+ dans le tissu irradié. Ceci confirme que le recrutement des progéniteurs de la moelle représente une quantité minime de cellules GFP+

dans notre modèle de rectite radique. Toutefois, du fait de la localisation, la taille et la forme de ces cellules isolées, ces dernières pourraient correspondre à des lymphocytes. Il serait intéressant d’effectuer des co-marquages de la GFP avec des marqueurs de la lignée lymphoïde tels que le CD4, CD8 ou CD11b pour mieux caractériser ces cellules isolées. Pendant un temps, l’expression de Tie2 était considérée comme homogène dans l’ensemble de l’arbre vasculaire. Cependant, les travaux d’Anghelina et al ont révélé que le promoteur Tie2 possède une activité préférentielle pour l’endothélium artériel microvasculaire (Anghelina et al. 2005). De manière surprenante, leurs résultats ont montré, via l’utilisation du modèle Tie2-GFP, que la GFP est exprimée seulement par la moitié des microvaisseaux mésentériques

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Figure 35 : Etude la spécificité du modèle Tie2-GFP : extinction de la GFP par greffe de moelle osseuse. Déplétion de la moelle de souris Tie2-GFP par irradiation corps entier ou TBI de 9,5 Gy, suivie d’une greffe de moelle de souris C57Bl/6 24h post-irradiation. Modélisation de la rectite radique par irradiation colorectale en dose unique de 27 Gy, 6 à 7 semaines post-greffe. Evaluation du recrutement cellulaire de la moelle vers le tissu irradié par marquage immunohistochimique de la GFP, 7 jours post-irradiation.

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