E. Etude du comportement du CABYV dans des mutants d’Arabidopsis affectés dans l’expression
E.1. Caractérisation des mutants KO d’ A. thaliana touchés dans les gènes candidats
Après avoir extrait l’ADN génomique des plantes mutantes ainsi que des plantes sauvages
Col-0, j’ai utilisé différents couples d’amorces (cf Matériel et méthodes) afin de confirmer l’insertion
de l’ADN-T dans le génome des plantes. Le site d’insertion des ADN-T pour chacun des mutants est
précisé dans le Tableau 20. Des oligonucléotides ont été conçus de manière à analyser également
l’homozygotie de l’insertion.
Pour le gène lsu3, je me suis procurée un mutant (SALK) dont l’insertion de l’ADN-T est localisée
dans la séquence codante du gène. La caractérisation de ce mutant par PCR a confirmé la présence
de l’ADN-T (amplification d’un fragment de 400 pb environ chevauchant l’ADN-T et le gène) (Figure
32) mais à montré également la présence d’un fragment d’ADN de 345 pb correspondant au
génotype sauvage (Figure 32, encart « Mutant lsu3 » PCR A). Le séquençage de ce fragment a bien
confirmé qu’il s’agissait du gène lsu3 et non pas d’un gène homologue, démontrant ainsi
l’hétérozygotie des mutants pour cette insertion. Une nouvelle sélection des plantes est en cours,
afin de pouvoir étudier l’implication du gène lsu3 dans le cycle du CABYV.
Pour le mutant touché dans le gène codant pour la glycosyl-hydrolase DIN10, l’insertion de l’ADN-T
au niveau de la région 5’ non codante du gène n’a pu être vérifiée par PCR. Néanmoins, chez ce
mutant l’absence d’amplification par PCR d’un fragment de type sauvage dans cette région (fragment
de 1000 pb amplifié dans Col-0) (Figure 32 – Encart « Mutant Din10 ») suggère la présence de
l’ADN-T dans le gène codant pour la protéine Din10.
Chapitre 1- Identification de partenaires phloémiens du CABYV potentiellement impliqués dans le cycle viral
- 83 - Gènes candidats Site d’insertion de
l’ADN-T Fond génétique
Nombre de lignées disponibles
Source
LSU3 AT3G49570 Exon Col-0 1 NASC
DIN10 AT5G20250 5’UTR Col-0 1 NASC
PRF1 AT2G19760 Exon I Col-0 2 B. Favery
PRF2 AT4G29350 Promoteur Ws 2 B. Favery
PRF3 AT5G56600 Exon I Col-0 2 B. Favery
PRF4 AT4G29340 promoteur Col-0 2 B. Favery
PRF5 AT2G19770 Intron 2 Ws 2 B. Favery
ALY1 At5G59950 Exon 5 Col-0 4 S. Mac Farlane
ALY2 AT5G02530 5’UTR Col-0 2 S.Mac Farlane
ALY3 AT1G66260 Exon 2 Col-0 2 S. Mac Farlane
ALY4 AT5G37720 Nda Col-0 4 S. Mac Farlane
a
: L’inhibition de l’expression du gène Aly4 est induite par ARN interférence grâce à l’insertion dans le génome d’arabidopsis, à une position non déterminée (Nd),d’une séquence antisens du gène à éteindre.
Tableau 20 : Caractérisation des mutants d’A. thaliana touchés dans l’expression des gènes candidats (ou leurs homologues) identifiés lors des criblages de la banque d’ADNc de cellules compagnes d’A. thaliana ou d’ADNc de puceron (A. pisum).
Chapitre 1- Identification de partenaires phloémiens du CABYV potentiellement impliqués dans le cycle viral
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Figure 32 : Caractérisation par PCR des mutants d’arabidopsis touchés dans les différents gènes candidats. La PCR (A) amplifie un fragment du gène dans la plante mutante (M) et dans la plante de référence Col-0, et la PCR (B) amplifie un fragment chevauchant l’ADN-T et le gène candidat dans la plante mutante. La taille, en paires de bases (pb), des fragments attendus est signalée. * : produit PCR aspécifique.
Pour les doubles mutants touchés dans les gènes aly, seule l’insertion de l’ADN-T à l’endroit attendu est montrée sur cette figure. Pour le gène Aly4, l’extinction du gène est faite par ARN interférence grâce à l’insertion dans le génome d’une séquence de 206 pb en antisens du gène, couvrant l’extrémité 3’ de l’exon 1 et l’extrémité 5’ de l’exon 2 (le fragment de 1015 pb amplifié correspond un fragment du gène Aly4 qui contient la séquence intronique).
Figure 33 : Analyse de l’accumulation des ARNm du gène prf3 par RT-PCR dans les deux lignées mutantes. A droite l’amplification d’un fragment de gène codant pour l’actine montre que les ARNm sont de qualité et de quantité identiques pour tous les échantillons analysés.
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Les mutants d’arabidopsis touchés dans les gènes codant pour les profilines ont été obtenus via
Bruno Favery (INRA de Sophia Antipolis) à partir des différentes collections disponibles (Versailles,
GABI et SALK) (Tableau 20). Les mutants touchés dans les gènes prf2 et prf5 ont été obtenus à partir
de l’écotype Ws (Wassilewskija) alors que les autres ont été obtenus à partir de l’écotype Col-0. Ces
mutants ont été sélectionnés par PCR et analyse génétique dans le laboratoire de Bruno Favery.
L’insertion de l’ADN-T dans le gène ciblé et l’homozygotie de deux lignées ont été vérifiées par PCR
grâce à des amorces spécifiques. Les résultats obtenus pour les deux lignées de chaque mutant étant
identiques, la Figure 32 (encarts « Mutant prf ») ne montre les résultats que pour une des deux
lignées. De plus, l’inhibition de la synthèse de l’ARNm codant pour la protéine PRF3 (protéine
candidate identifiée en criblant la banque d’ADNc de CC) dans les deux lignées mutantes a été
confirmée par RT-PCR (Figure 33).
Les mutants d’arabidopsis affectés dans l’expression des protéines ALY ont été obtenus par
l’intermédiaire de Stuart Mac Farlane (SCRI, Dundee). Après avoir confirmé l’insertion des ADN-T
dans les différents gènes Aly, des doubles mutants Aly1-3 et Aly2-4 ont été obtenus au laboratoire et
caractérisés (Figure 32 – encart « Doubles mutants aly »). Pour le double mutant ALY1/ALY3, dans les
3 plantes analysées, j’ai pu amplifier un fragment de 420 pb chevauchant le gène Aly1 et l’ADN-T, et
un fragment de 380 pb chevauchant le gène Aly3 et le second ADN-T. Pour les doubles mutants
ALY2/ALY4, dans les 4 plantes analysées j’ai pu amplifier un fragment de 248 pb chevauchant le gène
Aly2 et l’ADN-T. L’expression du gène Aly4 est réduite par ARN interférence, suite à l’introduction
dans le génome d’une séquence (206 pb) en antisens du gène Aly4, couvrant l’extrémité 3’ de
l’exon 1 et l’extrémité 5’ de l’exon 2 (séquence de l’intron non inclue). Pour confirmer la présence de
cette séquence antisens dans le génome des doubles mutants, un couple de primers s’hybridant sur
les exons 1 et 2 a été utilisé et un fragment de la taille attendue (206 pb) a été amplifié (sauf dans la
plante n°2, piste marquée d’un rond noir, qui ne semble donc pas avoir intégré la séquence). On note
par ailleurs une amplification d’un fragment de 1015 pb dans toutes les plantes analysées, qui
correspond à l’amplification du gène Aly4 (qui possède la séquence intronique). Afin de contrôler
l’homozygotie des doubles mutants, l’absence d’amplification de type WT pour chaque gène muté a
été vérifiée par PCR (résultats non montrés).
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