Caractérisation des mutants

 Caractérisation du niveau de fluorescence chez Mmm et M. bovis pour démontrer la versatilité du système d’expression

Pour obtenir une caractérisation plus précise et quantitative du niveau de fluorescence nous avons utilisé la cytométrie en flux. En effet, cette technique permet de quantifier le niveau de fluorescence d’un mycoplasme isolé à la différence du microscope de fluorescence qui reflète la fluorescence d’une colonie dans son ensemble sans pour autant la quantifier. Avec le cytomètre que nous avons au laboratoire nous ne pouvons caractériser que les mutants exprimant des fluorescences vertes comme mNeonGreen et GFP2. En effet, notre cytomètre ne dispose pas des équipements permettant la visualisation des fluorescences émises par mCherry et mKO2. Pour ces raisons pratiques la suite des analyses se fera exclusivement avec les clones mutants exprimant des fluorescences vertes.

Nous avons réalisé des analyses comparatives et quantitatives en cytométrie en flux pour différents clones exprimant la protéine fluorescente mNeonGreen chez Mmm et chez M. bovis (table 9). Ces expériences ont été réalisées à partir de cultures liquides en fin de phase exponentielle. Dans cette table figurent aussi les valeurs d’intensité de fluorescence des clones Mmm exprimant la protéine GFP2 optimisée qui n’avaient pas donné de résultats satisfaisants sur gélose. Ces résultats montrent que les différentes espèces sauvages (WT) étudiées n’ont pas la même auto fluorescence (M. bovis étant plus auto fluorescent que Mmm). Tous les clones mutants testés ont des niveaux de fluorescence supérieurs à celui de la souche sauvage respective. Néanmoins, on peut noter que les clones exprimant la GFP2 ont des niveaux de fluorescence bien inférieurs à ceux exprimant mNeonGreen. La même expérience a été faite après 7 jours de culture et les intensités de fluorescence mesurées avaient augmenté au cours du temps (données non montrées).

101

Table 9 : Comparaison des médianes d’intensité de fluorescence (MFI) des différents clones fluorescents exprimant la GFP2 (GX) chez les mutants de Mmm et la mNeonGreen (NX) chez les mutants de Mmm et M. bovis par rapport au souches sauvages. Résultats d’analyses réalisées en

cytométrie en flux

Les colonies du clone de Mmm N9 semblaient être beaucoup plus fluorescentes sur gélose (figure 24) et ce clone possédait effectivement une intensité de fluorescence nettement supérieure aux autres clones. Nous avons choisi de ne pas continuer les expériences suivantes avec ce clone, qui possède certainement plusieurs copies du transposon dans son génome et qui, de ce fait, peut posséder plusieurs mutations qui n’ont pas pu être caractérisées par séquençage. En effet nous ne sommes pas parvenus à identifier les différents lieux d’insertion des plusieurs copies du transposon dans le génome. Toutefois, il est intéressant de voir qu’une multiple insertion du système d’expression génique permet d’augmenter significativement l’intensité de fluorescence émise.

102

Figure 24: Comparaison des niveaux de fluorescence de colonies de Mmm après 3 jours de culture sur milieu gélosé. De gauche à droite : Mmm souche sauvage Rita (WT) et souches de Rita

transformées pour exprimer mNeonGreen, respectivement clones N6 et N9. De haut en bas : l’image a été prise au microscope optique en utilisant le contraste de phase et l’épi-fluorescence avec un filtre eGFP (vert) ou avec un filtre CY3 (Rouge). Grossissement X10.

Nous avons choisi les clones Mmm N6 et M. bovis N8 pour illustrer en détail les résultats de pourcentage de cellules fluorescentes dans la population générale (figure 25). Sur l’histogramme de cette figure nous pouvons voir une parfaite discrimination des mycoplasmes fluorescents par rapport aux souches sauvages, surtout pour les clones mutants de M. bovis. Les figures présentant une analyse en quadrants montrent également qu’il existe des niveaux d’intensité de fluorescence plus variables chez Mmm que chez M. bovis, avec la présence notamment d’une population non fluorescente y compris chez le mutant mNeonGreen.

103

Figure 25 : Analyses de la fluorescence en cytométrie en flux de M. bovis ou Mmm ; souche sauvage (WT) ou exprimant mNeonGreen clone N8 pour M. bovis et N6 pour Mmm après 24 heures de culture.

La colonne de gauche reflète la morphologie de la population (FSC vs SSC), celle du milieu la fluorescence en fonction de la taille (FSC vs mNeonGreen) et celle de droite un histogramme quantitatif du nombre de mycoplasmes en fonction de l’intensité de fluorescence.

Pour vérifier la reproductibilité des intensités de fluorescence nous avons réalisé trois expériences quantitatives indépendantes à partir de cultures liquides en fin de phase exponentielle des clones N6 pour Mmm et N8 pour M. bovis et leurs souches sauvages

104 respectives. Les résultats quantitatifs en médianes d’intensité de fluorescence (MFI) obtenus par cytométrie en flux sont présentés dans la table 10. Les MFI des mutants mNeonGreen de M. bovis sont supérieures à celles des mutants Mmm. Ceci est dû à une différence d’auto fluorescence entre ces deux espèces même chez les souches sauvages (WT). Pour analyser et pour pouvoir comparer le gain de fluorescence entre les souches sauvages et les souches transformées on a eu recours à un calcul de ratio de MFI. L’obtention de ces ratios nous permet de conclure que le gain de fluorescence est similaire chez M. bovis et Mmm. Ils varient de X10 à X17.

Table 10 : Comparaison des intensités de fluorescence entre les clones N6 (Mmm) et N8 (M. bovis) et leur souches sauvages respectives. L’expérience a été réalisée trois fois indépendamment en

cytométrie en flux. ^a médianes d’intensité de fluorescence (MFI), ^b ratio des MFI des clones fluorescents par rapport à leurs souches sauvages respectives.

Ces résultats ont permis de démontrer que le système d’expression développé initialement pour une utilisation chez le groupe mycoides peut être applicable, entre autre, au groupe hominis. Ces deux groupes phylogénétiques étant très éloignés (Sirand-Pugnet et al., 2007), l’outil d’expression de gènes est de ce fait versatile. En plus, l’analyse des intensités de fluorescence obtenues à partir des mutants mNeonGreen de Mmm et M. bovis est très satisfaisante et nous permet d’envisager leur utilisation pour les études d’interaction avec des cellules de l’hôte.

 Vérification de l’intensité de fluorescence émise par les mycoplasmes inactivés. Nous avons voulu savoir si les mycoplasmes fluorescents une fois morts continuaient à émettre de la fluorescence détectable. Cette information est indispensable pour savoir si les mycoplasmes fluorescents peuvent être détectés dans certaines expériences et après

105 différents traitements. Ainsi, nous avons tué à la chaleur (56°C pendant 30 minutes) nos mutants fluorescents N6 de Mmm et N8 de M. bovis, puis vérifié l’émission de fluorescence au court du temps en cytométrie en flux et en microscopie confocale. Nous avons montré que les mycoplasmes morts continuaient à émettre de la fluorescence à un niveau comparable au mycoplasme vivant, uniquement pendant 3 heures après le traitement à la chaleur. Passé ce délai la fluorescence n’est plus détectable par cytométrie en flux et microscopie confocale et ce, jusqu’à 72 heures après le traitement (données non montrées).

 Caractérisation du lieu de l’insertion

L’utilisation du système pMT/fluo entraîne une intégration au hasard dans le génome du mycoplasme de la construction permettant l’expression des protéines fluorescentes. Ainsi nous avons utilisé un système de séquençage permettant de localiser l’insertion d’une vingtaine de clones différents pour chacune des constructions chez Mmm et M. bovis. Les sites d’insertion des clones sélectionnés pour la suite des expériences sont précisés dans la

table 11. Les mutants sélectionnés ne devaient pas avoir eu l’insertion dans un gène ayant

un rôle clef pour la virulence in vivo. Les mutations engendrées par l’insertion ne devaient pas modifier la biologie du mycoplasme car toutes les études réalisées en aval s’en retrouveraient faussées. Nous avons donc sélectionné chez la plupart des mutants Mmm et M. bovis des mutations où l’insertion s’est produite, soit dans une transposase, soit dans des gènes présents en plusieurs copies dans le génome, soit dans des pseudogènes ou dans une région non codante. Pour le mutant de Mmm exprimant mKO2, le gène dans lequel s’est inséré le transposon est apparemment tronqué et flanqué par des sites d’insertion (IS).

Pour pouvoir sélectionner des clones mutants fluorescents intéressants pour les expériences d’interaction avec les cellules in vitro, nous avons fait attention à garder un nombre minimal de passages in vitro de ces clones. En effet, nous ne voulions pas introduire de biais qui seraient liés à une dérive génétique.

Les mutants mNeonGreen chez Mmm et M. bovis sélectionnés dans la table 11 sont les clones N6 pour Mmm et N8 pour M. bovis. Ce sont ces clones qui seront utilisés tout au long des analyses d’interaction avec les cellules de l’hôte.

106

Table 11 : Sites d'insertion du transposon dans les différentes souches mutantes fluorescentes chez

Mmm et M. bovis. Les sites d’insertion du transposon dans le génome des souches PG1 (n° Genbank

BX293980.2) de Mmm ou PG45 (CP002188) de M. bovis sont décrits par leurs annotations respectives. Nd ; non déterminé.