Candidats protéiques mis en évidence

Au travers des études protéomiques réalisées, nous avons pu mettre en évidence des protéines intervenant dans le processus de minéralisation à chacun des stades et/ou à chacun des évènements de l’initiation du processus de minéralisation. Parmi celles-ci, 20 candidats nous sont apparus déterminants au vu de leurs fonctions potentielles, de leur abondance dans le fluide ou la matrice organique de la coquille et de leur surabondance dans une des étapes-clés du processus de minéralisation. L’abondance de ces protéines dans nos analyses est en accord avec les résultats obtenus par Mann et collaborateurs (Mann et al, 2006). Nous identifions 14 des 32 protéines classées comme des protéines de la matrice organique de haute abondance et 4 (nucléobindine-2, glypican-4, HAPLN3, ovomucoïde) des 72 classées comme des protéines d’abondance intermédiaire. Les deux dernières, l’ovocalyxine-25 et LOC428451, ne sont pas identifiées par Mann et collaborateurs (Mann et al, 2006). Les 20 protéines sont décrites ci-après en fonction de leur fonction potentielle.

1.4.1 Protéines directement impliquées dans la minéralisation

Protéines connues pour jouer un rôle dans la minéralisation

L’ovotransferrine se distingue dans nos travaux par son abondance élevée tant dans le

fluide utérin (où elle est la protéine la plus abondante) que dans la matrice organique de la coquille (entre la 2^ème et la 5^ème protéine en terme d’abondance en fonction du stade) (articles

n°1 et 4). Elle apparaît surabondante au cours de l’initiation dans le fluide utérin comme dans la matrice organique de la coquille et plus particulièrement lors des premiers évènements de minéralisation caractérisés par le dépôt de carbonate de calcium amorphe (articles n°1 et 4). Ces observations sont en cohérence avec sa localisation au niveau des membranes coquillières et des noyaux mamillaires dans la coquille et sa mise en évidence en quantité plus importante au cours de l’initiation dans le fluide utérin lors d’une étude antérieure (Gautron et al, 2001b). Cette protéine est connue pour modifier la morphologie des cristaux de carbonate de calcium

in vitro (Gautron et al, 2001b). Au vu de sa surabondance, elle pourrait participer à la

stabilisation de la forme désordonnée de carbonate de calcium déposée lors des premiers évènements ou à la modification morphologique des cristaux de calcite.

L’ovalbumine est identifiée dans nos études comme une des protéines majeures de la

matrice organique de la coquille (5^ème protéine en terme d’abondance dans le fluide utérin et entre la 2^ème et la 7^ème protéine selon les stades dans la matrice organique) (articles n°1 et 4). Nos résultats indiquent une surabondance de l’ovalbumine au cours de l’initiation de la minéralisation à la fois dans le fluide utérin et dans la matrice organique de la coquille et plus particulièrement lors de la formation d’unités cristallines de calcite en accroissement (articles n°1 et 4). Ceci est en cohérence avec les résultats antérieurs qui indiquent que cette protéine est localisée au niveau des noyaux mamillaires dans la coquille (Hincke, 1995) et présente en quantité plus importante dans le fluide utérin lors de la phase d’initiation (Gautron et al, 1997). L’ovalbumine a la possibilité de lier le calcium et est considérée comme une éponge à cations (Schwahn et al, 2004, Pipich et al, 2008). Cette propriété suggère que l’ovalbumine serait un acteur important de la minéralisation. De plus, Pipich et collaborateurs (Pipich et al, 2008) ont observé in vitro des modifications de la structure tridimensionnelle de l’ovalbumine et une agrégation de la protéine en présence d’ions calcium. Ils ont également observé que la première forme de carbonate de calcium obtenue en présence d’ovalbumine est amorphe et que celle-ci se transforme ensuite en phases cristallines plus stables (vatérite puis aragonite). A partir de ces observations, ils ont élaboré un scénario de la minéralisation du carbonate de calcium en présence d’ovalbumine, représenté Figure 11.

Figure 11 : Formation de carbonate de calcium en présence d’ovalbumine (Pipich et al, 2008)

D’après ce scénario, l’ovalbumine lie les ions calcium (Figure 11 a), ce qui entraîne un changement de conformation de la protéine (Figure 11 b). Un certain nombre de molécules d’ovalbumine s’agrège (Figure 11 c). Du carbonate de calcium est formé par l’association d’ions carbonate aux ions calcium, dans un premier temps sous forme amorphe (Figure 11 d). Des formes cristallines de carbonate de calcium plus stables sont obtenues à partir de la forme amorphe à la suite d’une série de transformations chimiques (Figure 11 e). L’ovalbumine a également été montrée comme pouvant modifier la morphologie des cristaux de carbonate de calcium (Hernandez-Hernandez et al, 2008a, Wang et al, 2010) et pourrait aussi stabiliser la forme amorphe du carbonate de calcium (Wang et al, 2010).

Le lysozyme a été majoritairement localisé dans les membranes coquillières et les

noyaux mamillaires au niveau de la coquille et en quantité légèrement plus importante au cours de la phase de croissance au niveau du fluide utérin (Hincke et al, 2000). Il est la protéine de la matrice organique observée comme la plus abondante dans nos travaux (2^ème protéine dans le fluide utérin et 1^ère dans la matrice organique, tous stades confondus, en terme d’abondance) (articles n°1 et 4). Cette forte concentration est cohérente avec les

Western Blotting réalisés sur le fluide utérin et dans différents extraits protéiques de coquille (Hincke et al, 2000). Le lysozyme est une protéine majeure de la matrice organique quel que soit le stade de la minéralisation et peut être considéré comme un acteur important de la calcification. Cette protéine est connue pour modifier la morphologie des cristaux de carbonate de calcium in vitro (Hincke et al, 2000). De plus, deux études montrent que le lysozyme possède une capacité de stabilisation du carbonate de calcium amorphe in vitro (Voinescu et al, 2007, Wang et al, 2009b) mais ces résultats ne sont pas confirmés par une troisième étude (Wolf et al, 2011).

L’ovocléidine-17 apparaît comme la 11^ème protéine du fluide utérin en terme d’abondance et la 3^ème protéine de la matrice organique de la coquille, quel que soit le stade étudié (articles n°1 et 4). Nos travaux mettent en évidence que l’ovocléidine-17 est surabondante lors de l’initiation de la minéralisation tant dans le fluide utérin que dans la matrice organique de la coquille. Au cours de la phase initiale, elle est plus particulièrement concentrée lors de la transformation du carbonate de calcium amorphe en calcite. Cette surabondance est en adéquation avec les différentes hypothèses formulées sur le rôle de l’ovocléidine-17 dans le processus de minéralisation. Elle a été montrée comme pouvant modifier la morphologie des cristaux de calcite (Reyes-Grajeda et al, 2004). De plus, une simulation moléculaire a permis d’émettre l’hypothèse que cette protéine pouvait transformer le carbonate de calcium amorphe en calcite selon un cycle catalytique défini (Figure 12) : l’ovocléidine-17 se fixe à une particule de carbonate de calcium amorphe et conduit sa transformation en calcite. La croissance du cristal de calcite induit la libération de la protéine, qui est alors libre de se fixer à une nouvelle particule de carbonate de calcium amorphe (Freeman et al, 2010). Trois configurations de liaison au carbonate de calcium pour la catalyse ont été proposées (Freeman et al, 2011).

Figure 12 : Cycle catalytique de la transformation du carbonate de calcium amorphe en calcite par l’ovocléidine-17

(Freeman et al, 2010)

Protéines de liaison au calcium

Quatre protéines liant le calcium mises en évidence lors de nos études constituent des candidats fonctionnels majeurs pour intervenir dans le processus de minéralisation.

EDIL3 (EFG-like repeats and discoidin I-like domains 3) apparaît comme une protéine

importante de la matrice organique de la coquille entre 6 heures et 16 heures après l’ovulation (5^ème protéine à 6 et 7 heures et 4^ème protéine à 16 heures après l’ovulation) et est également présente dans le fluide utérin (51^ème protéine en terme d’abondance) (articles n°1 et 4). Elle est surabondante lors de l’initiation dans le fluide utérin et tout au long des étapes de la calcification dans la matrice organique de la coquille à l’exception du dépôt de carbonate de calcium amorphe 5 heures après l’ovulation (articles n°1 et 4). Il est à noter que son transcrit est retrouvé exprimé de façon importante par l’utérus (Brionne et al, 2014). Elle contient trois domaines de liaison type EGF-like, dont un seul lie le calcium. Ce domaine est un domaine d’environ 45 acides aminés. Six cystéines permettent la formation de trois ponts disulfures. Sa structure est composée de deux feuillets β à deux brins parallèles (Campbell and Bork, 1993). Ces deux feuillets forment une poche dans laquelle va pouvoir se loger le calcium.

MFGE8 (Milk fat globule-EGF factor 8 protein) apparaît comme la 20^ème protéine de la matrice organique de la coquille en terme d’abondance à 7 heures après l’ovulation et est également identifiée dans le fluide utérin (75^ème protéine) (articles n°1 et 4). Elle est reportée comme étant surabondante au cours de l’initiation de la minéralisation, que ce soit dans le fluide utérin ou la matrice organique de la coquille, et plus précisément lors de la formation

d’unités cristallines de calcite en accroissement dans la matrice organique (articles n°1 et 4). Comme pour EDIL3, son transcrit est retrouvé exprimé de façon importante par l’utérus (Brionne et al, 2014). MFGE8 appartient à la même famille qu’EDIL3 et comporte deux domaines de liaison au calcium de type EGF-like.

La nucléobindine-2 est la 16^ème et 12^ème plus abondante protéine à 7 et 16 heures après l’ovulation, mais n’est pas identifiée dans le fluide utérin (article n°4). Nos résultats soulignent que cette protéine est surabondante dans la matrice organique tout au long du processus de calcification à l’exception de la phase de dépôt de carbonate de calcium amorphe 5 heures après l’ovulation (article n°4). Ce résultat confirme ceux de l’analyse transcriptomique qui montre que le transcrit de la nucléobindine-2 est surexprimé par l’utérus lorsqu’une coquille est en cours de minéralisation (Jonchere et al, 2010). Elle contient deux domaines de liaison au calcium de type EF-hand. Le domaine EF-hand est composé d’environ 30 acides aminés. Il présente une structure en hélice-boucle-hélice : deux hélices α d’une dizaine d’acides aminés entourent un domaine plus flexible de 12 acides aminés dans le motif conservé. Comme pour le domaine EGF-like, la structure forme une poche où l’ion calcium peut se loger (Lewit-Bentley and Rety, 2000, Gifford et al, 2007).

L’albumine est la 3^ème protéine en terme d’abondance dans le fluide utérin et la 13^ème protéine à 5 heures après l’ovulation et 3^ème protéine aux 3 autres stades dans la matrice organique de la coquille (articles n°1 et 4). Elle est surabondante aux stades croissance et terminal dans le fluide utérin (article n°1) et lors de la mise en place de la couche palissadique dans la matrice organique de la coquille (article n°4). Ces propriétés de liaison au calcium (Kraghhansen and Vorum, 1993) font de cette protéine un candidat fonctionnel à étudier.

L’hémopexine (25^ème protéine du fluide utérin et entre la 11^ème et la 23^ème protéine de la matrice organique selon les stades, articles n°1 et 4) est surabondante durant l’initiation, à la fois dans le fluide utérin et dans la matrice organique de la coquille. Elle est plus particulièrement concentrée lors des premiers évènements de minéralisation caractérisés par le dépôt d’une phase désordonnée de carbonate de calcium (articles n°1 et 4). Cette protéine présente des capacités de liaison des ions métalliques divalents (Mauk et al, 2005) et pourrait donc lier les ions calcium pour stabiliser la phase amorphe.