Bradford

Lors de la redispersion de gels de micelles de caséine, la concentration en protéine dans le

surnageant est déterminée par la méthode de Bradford car c’est une méthode rapide et sensible pour

déterminer de faibles concentrations en protéines. Il s’agit d’un dosage colorimétrique utilisant le

réactif de Bradford contenant du bleu de Coomassie qui peut se lier à certains acides aminés des

protéines. Cette complexation du bleu de Coomassie avec les protéines est identifiée par un

changement de couleur détectée par une mesure d’absorbance à 595 nm en utilisant le spectro-mètre

UV-Visible (Uvikon 922, Milan, Italie).

0.1 mL de surnageant est prélevé après faible agitation du flacon afin d’homogénéiser le

surnageant. 1 mL de réactif de Bradford (Bradford reagent Sigma-Aldrich, St. Louis, Etats Unis) a été

ajouté au surnageant dans une cuve de spectrophotométrie. La cuve est laissée au repos 15 min afin

de laisser la complexation se faire. L’absorbance de la cuve est ensuite mesurée à 595 nm (Abs

595nm

).

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Bradford a été réalisée dans les mêmes conditions afin de soustraire l’influence de la valeur

d’absorbance du PUF sur l’absorbance du surnageant. À partir de la valeur de l'absorbance du

surnageant, la concentration des caséines est obtenue grâce à une courbe étalon (Figure II.17) qui a

été initialement déterminée avec des dispersions de micelles de caséines de concentrations connues

(0 - 0.5 g/kg). L’équation qui régit cette courbe étalon est :

[𝐶𝑎𝑠] = 0.76 × (𝑒

0.45×𝐴𝑏𝑠 595𝑛𝑚

− 1) Eq.II.31

Figure II.20.Evolution de la concentration des caséines en fonction de l’absorbance à longueur

d’onde 595 nm des dispersions de micelles de caséine. La courbe correspond à l’équation Eq.II.25.

Dosage des minéraux

Les dosages des minéraux et acides organiques (calcium, sodium, phosphates, citrates, …) ont

été réalisés sur les PUF. Le dosage des ions calcium, magnésium et sodium a été réalisé par

spectrométrie d’absorption atomique (SAA 220 FS Varian, Les Ulis, France) suivant le protocole de

(Brule et al. 1974). Le dosage des anions citrate, phosphate et chlorure a été réalisé par

chromatographie liquide échangeuse d’ions (Dionex DX-500, Jouy-en-Josas, France) (Gaucheron et al.

1996).

Les minéraux totaux sur la poudre ont été déterminés par séchage de la poudre à 550 °C

pendant 5 h afin d’obtenir la proportion de cendres (AFNOR Norme française NF V04-208 1989).

Extrait sec total

La concentration en caséine et l’hydratation des gels micelles de caséines ont été déterminées

par mesure de l’extrait sec total (EST) (7 h, 105°C à l’étuve) (AFNOR Norme française NF V04-348 1978).

L’extrait sec total a été mesuré sur les poudres (𝐸𝑆𝑇

𝑝𝑜𝑢𝑑𝑟𝑒

), les dispersions de micelles de caséine

liquides obtenues par dissolution de la poudre et des dispersions de micelles de caséines gélifiées

obtenues par compression osmotique (𝐸𝑆𝑇

_{𝑑𝑖𝑠𝑝}

) et les perméats d’ultrafiltration (𝐸𝑆𝑇

_𝑃𝑈𝐹

).

Turbidité

La turbidité (τ) des surnageants de redispersion des gels a été déterminée par mesure de

l'absorbance sous des longueurs d'onde entre 400-800 nm en utilisant le spectromètre UV–Visible

(Uvikon 922, Milan, Italie). L’appareil délivre l'intensité de transmission (I

t

) qui traverse la dispersion

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dans une cuve d'épaisseur L (cm) (des cuves de 1 cm ont exclusivement été utilisées). Un blanc sur du

PUF permet de déterminer l'intensité de transmission qui traverse le solvant (I

0

). La turbidité (τ, cm

-1

)

est alors calculée selon l’Eq.II.32 :

𝜏 = ln ( ^𝐼

⁰

𝐼

_𝑡

⁾

1

𝐿 ^Eq.II.32

Grâce à la mesure de la turbidité, l'intégrité des micelles de caséine peut être estimée comme

décrit dans le travail de Pitkowski et al. (2008) et Qu et al. (2015). Il existe en effet une relation de

linéarité entre la turbidité et la longueur d’ondeλ (nm) décrite par :

𝜏 = 𝐴 × [𝐶𝑎𝑠] × 𝜆

𝑛

Eq.II.33

où A est une constante liée à la masse molaire des particules, n dépend du facteur de structure des

particules. Pour les dispersions de micelles de caséine (PPCN + UF) dans une gamme de concentration

de 0.5 - 5 mg/g, "A" et "n" sont constants avec A = 5.0 – 6.0 × 10

7

et n = -2.8.

Lors de la redispersion des gels de micelles de caséine, des objets sont libérés dans le

surnageant et il est alors possible de vérifier s’il s’agit de micelles de caséine ou d’autres objets par la

mesure de la turbidité. En effet, si le facteur de structure n est du même ordre que -2.8, lors de la

mesure de la turbidité dans le surnageant sur des longueurs d’ondes allant de 400 à 800 nm, alors il

s’agit de micelles de caséine. Dans le cas contraire, si le facteur de strutcure n est éloigné de la valeur

-2.8, alors les objets libérés ne sont pas des micelles de caséine, ou alors elles ont changé de structure.

Mesures de taille

Après dissolution de poudre dans du PUF pour fabriquer les dispersions de micelles de caséine

et lors des redispersions de gels de micelles de caséine pour les tests de cohésion, des mesures de

distribution de taille ont été réalisées à 20 °C à l’aide d’un DLS- zetasizer 3000 HS (Malvern, UK). Cette

technique d’analyse est non destructive et permet d’accéder à la taille de particules en suspension

dans un liquide. Le principe repose sur des fluctuations temporelles de l’intensité diffusée par les

particules en suspension.

Un laser He-Ne de longueur d’onde de 633 nm est émis sur une suspension. Les particules vont

diffuser de la lumière et ces données vont être enregistrées par un détecteur en zone de rétrodiffusion

des particules. Or ces particules sont soumises au mouvement brownien. Il en résulte alors des

interférences constructives ou destructives au cours du temps, qui vont se traduire par une courbe

d’auto-corrélation en intensité puis en vitesse et ainsi remonter au rayon hydrodynamique de la

particule. La méthode de Contin (Provencher 1982) a été utilisée pour évaluer les données

expérimentales et déterminer la distribution de taille moyenne des particules. Les paramètres utilisés

pour ces mesures de taille sont ceux préconisés par Regnault et al. (2004) et recalculés pour T = 20 °C:

les paramètres sont donnés dans la Table II.3.

Table II.3. Paramètres utilisés pour les mesures de la distribution de taille à 20°C.

Viscosité (cp) Index de réfraction

Micelle de caséines - 1.570

Chapitre III: Propriétés physiques et

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