b Les méthodes de quantification avec marquage isotopique

La comparaison du protéome d’échantillons issus de conditions différentes et d’une même acquisition est facilitée s’il existe un élément qui permet de distinguer les différentes conditions. Ainsi les méthodes de marquage isotopique consistent à introduire un marqueur sur les peptides

62 ou les protéines. En effet, en spectrométrie de masse, il est possible de mesurer la différence de masse entre un peptide marqué et un peptide non marqué (Figure 23).

Cette approche se traduit par le marquage de chaque échantillon par différents isotopes stables (D, C13, N15, O18) et puis de les comparer entre eux. Les paires peptidiques ainsi formées sont différenciées par un écart de masse (Δm) au sein d’une même acquisition.

Figure 23 Extraction des données quantitatives à partir d’un spectre de masse. (A gauche) Visualisation de chaque peptide marqué en rouge et non marqué en noir. A droite : courbe de l’élution chromatographique, le signal peptidique est suivi par la courbe dont l’aire correspond au courant mesuré (XIC), une mesure proportionnelle à l’abondance du peptide (Ong and Mann, 2005).

Parmi les nombreux marquages qui sont introduits par une voie chimique, la technologie ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) (Hansen et al., 2003) : cette méthode consiste à utiliser des étiquettes (tags) isotopiques distinctes pour marquer spécifiquement les résidus cystéines des protéines par liaison covalente grâce à un réactif comprenant soit du 12C ou 13C.

Il existe aussi la technique Tandem mass tag ( TMT) ou iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolute quantitation) (Thompson, Schäfer, et al., 2003) qui va permettre la quantification de plusieurs échantillons simultanément. Cette méthode permet le marquage du groupement amines des peptides générés par digestion trypsique par un réactif associé à des étiquettes isobariques qui génèrent des ions rapporteurs de masses spécifiques lors de la fragmentation MS/MS des ions parents (Timothy J. Griffin et al., 2007). Ce type de marquage peut d’autre part être réalisé par incorporation de 18_{O au moment du processus de digestion enzymatique des} protéines en présence de H218O (Xudong Yao et al., 2001; Kristy J. Reynolds, Xudong Yao and Fenselau, 2002). Les peptides sont mélangés de façon équimolaire et analysé en LC MS/MS. Lors de la fragmentation en MS/MS, le rapporteur a une grande intensité sur le spectre, et

63 permet la quantification du peptide dans l’échantillon. Ces techniques de quantification se sont largement répandues et ont été appliquées à différents fluides et tissus.

Il existe aussi un autre marquage, le marquage métabolique type SILAC (Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture) qui consiste à mettre en culture les acides aminés marqués qui seront incorporés par la suite dans la chaine protéique cellulaire de la cellule. Il est souvent pratique d’avoir recours à un double marquage des lysines et des arginines pour optimiser la quantification notamment lors d’une digestion enzymatique à la trypsine permettant ainsi d’avoir tous les peptides quantifiables.

Cette technique est souvent utilisée dans les cellules pour détecter de faibles variations quantitatives ainsi que pour la caractérisation et la dynamique des modifications post traductionnelles (Blagoev et al., 2003) . Elle peut, notamment, être utilisée pour les tissus et pour les fluides (Zanivan, Krueger and Mann, 2011).

Nous avons eu recours au marquage isobarique au cours de ce projet et nous présentons dans le paragraphe suivant le principe de cette technique :

i. Le marquage isobarique TMT

Le marquage isobarique TMT est une technique quantitative qui a été développée, en 2003, par l’équipe de Thompson (Thompson, Jürgen, et al., 2003).

Le TMT est constitué d’un groupe réactif N-hydroxysuccinimide (NHS) qui permet le marquage en formant, par une liaison covalente avec les amines primaires de l’extrémité N- terminal et de la chaine latérale des résidus lysine, un groupe rapporteur (dont la masse varie de 126 à 131 Da) permettant d’évaluer l’abondance relatif du peptide en analyse MS/MS dans un échantillon donné, un linker clivable qui sera responsable de la libération du fragment rapporteur TMT en analyse MS/MS et d’un groupe de normalisation de masse servant à équilibrer les différences de masse entre les différents fragments rapporteurs pour que la masse globale des marqueurs soit équivalente (230 Da) (Figure 24A).

Ces différents marqueurs ont, à la fois, la même masse moléculaire de 230 Da et la même structure chimique (Figures 24 et 25). Ainsi, lors de l’analyse de spectrométrie de masse, les peptides marqués seront détectés avec la masse relative du peptide en plus de la masse du réactif TMT. Mais lors de la fragmentation HCD, ces groupements rapporteurs seront libérés.

64 L’intégration de l’aire sous les pics relatifs au rapporteur, permettra d’évaluer la proportion de peptides marqués dans l’échantillon duquel ils dérivent (Figure 26).

Figure 24 Schéma explicatif représentant la structure chimique des réactifs TMT. (A) les différentes régions composant la structure du TMT et les sites de fragmentation MS/MS par HCD et ETD (B) Les réactifs des TMT10plex et du TMT 11-131C et les positions des isotopes (indiqué par une astérisque) (Scientific, 2014)

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Figure 26 La procédure d’utilisation du kit TMT10plex en utilisant le kit 10plex Label Reagents.(Scientific, 2014)

Ces étiquettes isobares multiplexes apparaissent à la même masse dans un balayage MS, mais lors de la fragmentation CID dans le spectromètre de masse, donnent lieu à des ions de signature MS / MS de faible masse entre 126 et 131 m / z (TMT) correspondant à la perte de rapporteur. Les pics ou zones relatifs au rapporteur indiquent la proportion de peptides marqués de l'échantillon dont ils sont dérivés (Figure 25).

Cette technique a plusieurs avantages dont principalement la quantification simultanée de chaque peptide et en conséquence des protéines, la possibilité de quantifier les peptides d’un protéome complexe en un temps faible par rapport à d’autres méthodes comme la 2D ou le label free. Cette technique permet, notamment, la comparaison de différentes conditions (contrôle et traité) en ayant plusieurs points par condition et aussi comparer différentes conditions par rapport à des contrôles en intégrant les différentes conditions dans la même injection (Figure 26). D’ailleurs, plusieurs combinaisons de Tag existent : les duplex TMT-2plex, les TMT- 4Plex, les TMT0 6-plex, les TMT-10 plex et, récemment, ThermoFisher a développé les TMT- 11plex.

Au cours de ce projet, nous avons utilisé une quantification par TMT. En effet, ce marquage combiné à une analyse en QExactive Plus en HCD, nous a aussi permis d’obtenir autant d’ions

66 y que b car le marquage TMT ajoute des charges basiques permettant une meilleure ionisation et une meilleure fragmentation des peptides.

II.

Approche transcriptomique

Lors de ce projet, nous avons eu recours à une méthode « omique » largement appliquée. Cette méthode est la transcriptomique qui, tout comme la protéomique étudie les protéines, elle s’intéresse aux acides ribonucléiques : les ARNs.