a L’extraction des protéines

La préparation des échantillons est une étape importante pour obtenir un résultat fiable et reproductible. L’extraction permet la solubilisation de toutes les protéines d'un échantillon, sans aucunes modifications chimiques, en éliminant tous les composés interférents (acides nucléiques, polysaccharides, polyphénols, lipides, etc.) et tout en étant compatible avec la méthode analytique qui sera utilisé par la suite. Il n'existe pas de protocole universel pour la préparation des échantillons, bien que plusieurs protocoles aient été adaptés en fonction de l'échantillon biologique et des objectifs de l'étude (Rabilloud and Lelong, 2011). Ainsi, il est important de connaitre la composition de l’organe ou des cellules mais aussi la nature et la localisation des protéines recherchées pour définir le protocole d’extraction à adopter.

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I.1.b. La séparation des protéines

L'étape de séparation est utilisée pour réduire la complexité de l'échantillon avant l'analyse de masse. Elle peut être réalisée directement sur des protéines ou sur l'ensemble des peptides issus de la digestion enzymatique des protéines correspondantes. La séparation des protéines ou des peptides peut être réalisée de deux manières :

• In-gel : « en gel », basée sur l'électrophorèse

• Gel free : « sans gel », basée essentiellement sur la chromatographie.

La stratégie suivie dans ce travail de thèse est la méthode « In gel » par électrophorèses suivi d’une digestion enzymatique des protéines par la trypsine. Celle-ci permet de produire des coupures au niveau des liaisons peptidiques dans la partie C-terminale des résidus basiques : lysine ou arginine. Cette digestion enzymatique permet de créer des espèces multichargés 2+ et 3+ (Olsen, Ong and Mann, 2004). Les peptides obtenus ont une masse de 10 à 15 acides aminés à la capacité d’acquisition des spectres MS.

Figure 14 Workflow de la préparation de l'échantillon en vue d'une analyse protéomique à partir de cellules ou de tissus, il est possible aussi d'enrichir ou de fractionner l'extrait protéique avant la digestion enzymatique

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I.1.c. La séparation par HPLC

La chromatographie est une technique permettant la séparation des analytes en fonction de leurs propriétés physico-chimique. Elle est basée sur la différence de miscibilité d’un composé entre deux phases non miscibles. Cette technique est basée sur les différences d’affinités entre la substance à analyser, la phase stationnaire (la colonne) et la phase mobile (l’éluant).

La détection d’un analyte est représentée par un chromatogramme représentant un ensemble de pics gaussiens. Dans des conditions d’analyse particulière, une molécule est caractérisée par son temps de rétention (tr) et la largeur du pic à mi -hauteur (w1/2) (Figure 15).

Figure 15 Chromatogramme d’un composé analysé représentant les pics relatifs à l’analyte et la largeur de mi-hauteur (w1/2) et en abscisse le temps de rétention (tr).

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est, actuellement, l'un des outils d'analyse les plus puissants qui a révolutionné le domaine de la protéomique. Anciennement connue sous le nom de chromatographie liquide à haute pression, cette technique a été introduite au début des années 1960 pour améliorer l'efficacité des séparations par chromatographie liquide en utilisant de petites particules en phase stationnaire fixées sur des colonnes.

Aujourd’hui, il existe différents types de colonnes dans différents matériaux qui sont combinées à plusieurs modes d’HPLC permettant ainsi d’identifier et de quantifier des peptides et des protéines avec une sensibilité et une résolution élevée à partir de quantités limitées d'échantillon ou d’échantillon complexe.

La chromatographie de partage à polarité de phases inversées (RPLC) est la plus souvent employée. Elle s’adapte parfaitement en couplage avec la spectrométrie de masse et s’adapte aussi à des pourcentages importants de solvants organiques, paramètre favorable à la bonne ionisation des composés dans une source électrospray.

48 Le choix du couplage à utiliser est dépendant de la masse des composés à étudier. En effet, la LC-MS/MS couplée à l’électrospray permet l’ionisation des molécules polaires et ayant une masse variant de 101 à 106.

Ce couplage permet de réaliser des analyses LC-MS/MS permettant de s’affranchir d’un fractionnement extensif des protéines en amont de l’analyse en spectrométrie de masse et de réaliser ainsi l’étude d’un protéome complexe en une seule analyse.

L'introduction de la Chromatographie Liquide Ultra Haute Performance (UHPLC) a encore amélioré le niveau de performance de la séparation avec des augmentations significatives de la résolution, de la vitesse et de la sensibilité. En effet, en augmentant le débit, la résolution a été améliorée et le temps d’analyse a diminué (de Villiers et al., 2006). Les matrices biologiques complexes contiennent plusieurs composés ayant des propriétés physico-chimiques similaires. Ces composés peuvent être élués au même temps entrainant des compétitions d’ionisation dans la source du spectromètre de masse. L’utilisation de l’UPLC minimiserait le phénomène de suppression d’ionisation à la source et améliore ainsi la séparation des pics chromatographiques (Chambers et al., 2007).

Une autre technique d’analyse prometteuse existe : c’est la nano chromatographie, qui est plus récente et qui a recours à des colonnes capillaires de 50 à 100 μm. Couplée à des spectromètres de masse à ultra-haute résolution, cette technique séparative est devenue incontournable pour les analyses protéomiques et permet un gain théorique en sensibilité (un facteur de plusieurs centaines en comparaison avec des colonnes classiques de 2,1 mm) pour quelques microlitres d’échantillon injectés.

Cependant, cette technique n’est pas compatible avec des échantillons denses et complexes représentant un protéome global d’un organe, mais elle est plutôt adaptée aux échantillons issus d’un fractionnement préalable soit par compartiment cellulaire ou notamment par immunoprécipitation. Ainsi, au cours de ce projet de thèse, nous avons utilisé une chromatographie capillaire en injectant 5µl par échantillon. La chromatographie capillaire nous a permis d’augmenter la robustesse et d’avoir une meilleure qualité des spectres.

i. La phase stationnaire

En chromatographie de partage à polarité de phases inversées (RPLC), les phases stationnaires les plus employées sont constituées de billes de silice greffées par des chaînes alkyle (le plus souvent C18, mais aussi C8 ou parfois plus courtes). Les propriétés de rétention dépendent du taux de greffage de chaines carbonées sur la silice, du type de griffons ou en modifiant le greffage de la silice (diphényl, phénylhexyle). Les particules de phase stationnaire ont des

49 diamètres compris entre 1 et 5 μm, la taille des pores variant entre 80 et 300 Å. Les composées seront éluées par polarité décroissante sur ces phases stationnaires.

ii. La phase mobile

Les phases mobiles utilisées sont constituées de deux phases : une phase aqueuse et une phase organique d’élution (acétonitrile ou méthanol). Il existe deux modes de pompage des phases mobiles : un mode isocratique et un mode gradient (Wiczling et al., 2008). Lorsque la composition de la phase mobile évolue au cours du temps, on parle d’un mode « gradient ». Au contraire, dans le mode « isocratique », la phase mobile est invariable. Pour notre étude nécessitant la séparation d’un mélange complexe, les analyses ont été effectuées en augmentant au cours du temps le pourcentage de solvant organique dans la phase mobile.

Les phases mobiles sont, habituellement, acidifiées pour augmenter la résolution des pics chromatographiques observés, en ajoutant des acides organiques volatils tels que l’acide trifluoroacétique (TFA), l’acide acétique ou l’acide formique. Ces acides interagissent avec les analytes et augmentent leurs hydrophobies en formant des paires d’ions. Il est important de prohiber l’utilisation de sels lors de la préparation de l’échantillon, ces derniers pouvant former des adduits avec les analytes et polluer la source électrospray.