Autophagie non sélective : Macro-autophagie

L’utilisation du modèle de la levure Saccharomyces cerevisiae a largement facilité l’étude de l’autophagie. Ce modèle a permis un dépistage des protéines impliquées dans l’autophagie grâce à l’analyse des modèles incapables d’induire l’autophagie suite à une baisse de la concentration en nutriments. Ces études ont mené à l’identification d’une famille de protéines essentielles à l’autophagie, il s’agit des protéines Atg (AuTophGy-related protein). Des analyses géné- tiques chez la levure datant des années 1990 ont identifié environ 35 protéines impliquées dans l’autophagie [Nakatogawa et al., 2009]. Parmi ces protéines Atg on va distinguer un “noyau de protéines” dont font parties 18 des protéines Atg qui vont participer à la forma-

tion de l’autophagosome. Ce noyau de protéines Atg est hautement conservé chez les eukary- totes et respecte leur ordre d’intervention qui est conservé entre la levure et les mammifères [Klionsky et al., 2003].

4.1.1.1 Les étapes de l’autophagie

Le processus d’autophagie est décrit en plusieurs étapes. Il va y avoir tout d’abord une étape de nucléation et de formation de la membrane d’isolation, suivie d’une phase d’élongation, puis de maturation de l’autophagosome et enfin la membrane externe de l’autophagosome va fusionner avec le lysosome pour former l’autolysosome, où le matériel cytoplasmique va pouvoir être dégradé. Ces étapes vont être réalisées grâce à l’intervention successive de nombreux complexes moléculaires au sein desquels on retrouve les protéines Atg (figure 4.2).

Complexe ULK1-ATG13 FIP200-Atg101

mTORC1

Insuline

facteurs de croissance acides aminés

Complexe ULK1-ATG13 FIP200-Atg101 Atg9L

? _{Beclin 1-ATG14}Complexe

Ambra1-Vps15 Vps34(PI3K) LC3- PE LC 3-P E P I3 P WIPIs P I3 P Complexe Atg12-Atg5 Atg16L1 LC3- PE LC 3-P E Omégasome membrane d'isolation RE ? autophagosome mature PI3P DFCP1 Beclin 1 Bcl2

Figure 4.2: Formation des autophagosomes Adapté de [Mizushima and Komatsu, 2011]

Parmi ces complexes on va retrouver entre autres le complexe ULK1 (ULK1, FIP200, Atg13L et Atg101), le complexe VPS34 (VPS15, VPS34, Beclin-1, Atg14 et UVRAG), le système de conjugaison ATG12 de type ubiquitin (Atg5-Atg12-ATtg16L1) et le système de conjugaison LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 de type II).

Lors de l’étape d’initiation de l’autophagie, le complexe ULK1 va être activé et translo- qué à un certain endroit du réticulum endoplasmique. Il va activer le complexe PI3K (kinase de classe III 3 phosphatidylinositol), qui va recruter les protéines Atg au niveau de la mem- brane d’isolation (phagophore). Suite à l’activation, VPS34 va produire du phosphoinositol

3 phosphate (PI3P) qui va soutenir l’expansion de la membrane de l’autophagosome jusqu’à sa fermeture par les protéines Atg. La formation de PI3P va entrainer le recrutement de la protéine DFCP1 (Double FYVE-Containing Protein 1) qui va promouvoir la formation de l’omégasome. Les autres protéines WIPI se liant aussi au PI3P sont nécessaires à la matura- tion de l’omégasome et de la membrane d’isolation. Au cours des phases d’élongation et de terminaison deux systèmes de conjugaison vont intervenir : les systèmes de conjugaison Atg12 et LC3 qui seront décrits plus en détails dans la suite du manuscrit. Le recrutement de Be- clin 1 au niveau du complexe PI3K est aussi sensible aux conditions de l’environnement. En conditions riches en nutriments Beclin 1 forme un complexe avec Bcl2 au niveau du réticulum endoplasmique et Beclin 1 est libéré lors de la phosphorylation de Bcl2 par JNK1.

4.1.1.2 Origine de la formation de l’autophagosome

L’autophagosome est un organite unique de par sa structure mais aussi par la dynamique de sa régulation. En effet la formation de l’autophagosome est hautement inductible et sa quantité peut être multipliée par 10 lors d’épisode de privation en nutriments. Ils sont ensuite rapidement dégradés par le lysosome. Leur temps de demie vie peut être de 10 à 25 min dans le foie [Hailey et al., 2010].

L’étude moléculaire de l’autophagie a été réalisée en partie grâce à des études génétiques chez la levure dans laquelle les modifications génétiques ont permis de mettre en avant les rôle des protéines Atg. L’identification des protéines Atg et l’étude de leur fonction a grandement participé à la compréhension en détails de l’autophagie et la formation de l’autophagosome.

La formation de l’autophagosome va démarrer par la formation d’une structure appelée PreAutophagosomal Structure (PAS) chez la levure. Cependant les preuves de son existence chez les mammifères sont encore limitées. Le PAS pourrait être attaché ou proche du réticulum endoplasmique qui servirait de plateforme de formation chez les mammifères (figure 4.2). Une étude [Hamasaki et al., 2013] a montré que chez les mammifères, la formation des autophago- somes prenait naissance au niveau d’un site de contact entre la mitochondrie et le Réticulum Endoplasmique (RE). Ils ont notamment montré le recrutement de la protéine Atg14L à ce point de contact. La protéine Atg14L1 est impliquée dans le complexe autophagique PI3K nécessaire à la formation des autophagosomes. En conditions nutritives suffisantes, cette protéine diffuse au sein de la membrane du réticulum endoplasmique. Enfin ils ont aussi montré que la protéine Atg5, qui est une protéine qui se fixe uniquement à la membrane d’isolation, était aussi recrutée au point de contact entre la mitochondrie et le RE, indiquant ainsi que l’autophagosome sera localisé à ce point de contact jusqu’à la finalisation de sa formation. De plus la dissolution de ce point de contact entre la mitochondrie et le RE empêche l’accumulation d’Atg14L démon- trant l’importance de ce dernier dans l’initiation de la formation des autophagosomes. Chez la levure il a été identifié que les protéines Atg11 et Atg17 sont les facteurs les plus en amont de la formation du PAS. Atg11 n’est pas essentiel pour l’induction de l’autophagie en conditions de privation mais semble cependant l’être pour l’induction de certaines autophagies sélectives. Ainsi le PAS est constitutivement présent et cela même lorsque les conditions en nutriments

sont suffisantes. Dans des conditions de privation, les protéines nécessaires à l’induction de la macroautophagie Atg17, Atg29 et Ag31 qui sont normalement dispersées dans le cytoplasme, vont se réunir autour du PAS. Une fois les conditions en nutriments rétablies les protéines Atg se dispersent de nouveau dans le cytoplasme.

Le PAS permettrait ensuite la génération de la membrane d’isolation, cependant cette trans- formation n’est pas directe et l’origine lipidique de cette membrane d’isolation reste encore aujourd’hui une interrogation pour les scientifiques. Des études de tomographie électronique ont apporté quelques indices sur le rôle du réticulum endoplasmique [Yla-Anttila et al., 2009, Hayashi-Nishino et al., 2009]. Le réticulum endoplasmique adopterait une forme de courbe en- tourant la membrane d’isolation. Et c’est au sein de cette structure que se ferait l’élongation de l’autophagosome. Cette hypothèse reposant uniquement sur des expérimentations statiques, d’autres études sont nécessaires afin de la confirmer. Cependant le RE ne serait pas la seule source membranaire impliquée dans la formation des autophagosomes. D’autres études ont montré [Itoh et al., 2008, Young et al., 2006] que la protéine Rab33B, protéine impliquée dans la régulation du trafic membranaire qui se trouve normalement dans l’appareil de Golgi, in- teragit avec Atg16L et Atg9L1 et ce complexe est retrouvé dans la membrane autophagique lors de l’induction de l’autophagie. Ainsi la membrane de l’appareil de Golgi et des endo- somes pourraient aussi contribuer à la formation des autophagosomes. Enfin d’autres études [Mizushima et al., 2011] suggèrent que la membrane plasmique et la membrane nucléaire pour- raient constituer un réservoir. Il semble donc que l’origine lipidique des autophagosomes puisse être multiple. Il reste encore à déterminer si cette origine est toujours multiple ou bien si cela dépend des conditions (voie d’activation, type d’autophagie). L’origine lipidique de la mem- brane de l’autophagosome n’est donc pas encore complètement élucidée. La forte proximité des autophagosomes avec le réticulum endoplasmique suggère que ce dernier pourrait constituer le réservoir principal mais la formation des autophagosomes est loin d’être simple et une autre étude [Hailey et al., 2010] a montré que la membrane externe de la mitochondrie pouvait servir de réservoir à la formation des autophagosomes. Ceci soulève aussi l’hypothèse que la prove- nance des lipides à l’origine de la formation des autophagosomes pourrait varier selon l’origine du stress ayant entainé l’activation de l’autophagie.

4.1.1.3 Méthode d’analyse de la macroautophagie

Le mécanisme de macroautophagie est analysé essentiellement par le suivi de la dégradation des autophagosomes. Le flux autophagique correspond à la quantité d’autophagosomes dé- gradés. La protéine LC3-I est incorporée dans la membrane de l’autophosome en forma- tion suite à sa lipidation pour donner LC3-II. La lipidation de cette protéine a été montrée comme un bon indicateur de la quantité d’autophagosomes présents au sein de la cellule à un temps donné [Kabeya et al., 2000]. Cette quantité peut être détectée par western blotting car les poids moléculaires de LC3-I et LC3-II sont différents. Malgré un poids moléculaire plus important que LC3-I, LC3-II migre plus rapidement du fait d’un changement confor- mationnel. La formation des autophagosomes peut aussi être analysée par des techniques

d’immunofluorescence via le marquage de LC3 qui va être détecté par des points au niveau de la membrane de l’autophagosome. Cependant le mécanisme d’autophagie est un processus dynamique et le nombre d’autophagosomes est fonction de la balance entre leur taux de syn- thèse et leur taux de conversion dans les lysosomes, c’est à dire leur dégradation. Identifier la quantité d’autophagosomes présents à un temps t n’est donc pas suffisant pour rendre compte de la dynamique du phénomène. Dans la figure 4.3

conditions normales sur un temps t autophagosomes dégradés à l'état basal autophagosomes produits à l'état basal activation de la production d'autophagosomes arrêt de la production arret de la dégradation activation du taux de dégradation

autophagosomes non dégradé ou produit sur un temps t

Quantité d'autophagsome détectable sans traitement bafilomycine

Quantité d'autophagsome détectable avec traitement bafilomycine

activation de la production d'autophagosomes arret de la dégradation activation du taux de dégradation Résultante condition avec Baf-condition sans baf

arrêt de la production

quantité d'autophagosomes détectable dans la cellule traitement traitement Baf traitement Baf traitement Baf traitement Baf conditions normales sur un temps t quantité d'autophagosomes dégradée A B C D E E' D' C' B' B'-B C'-C D'-D E'-E A' A'-A

Figure 4.3: Analyse de l’autophagie, un processus dynamique

Nous illustrons ici une méthode d’analyse du flux autophagique c’est à dire la quantité d’autophagosomes dégradée (soulignée par un trait rouge), proposée par [Jiang and Mizushima, 2015] reposant sur l’utilisation de la bafilomycine qui bloque la dégradation des autophagosomes [Zhang et al., 2007]. En condition normale (A) l’autophagie peut avoir lieu, on parle d’autophagie basale. Il s’agit d’un état stable où la quantité d’autophagosomes produite est égale à la quantité d’autophagosomes dégradée. Les différents cas de figures sont représentés suite à traitement. Dans cet exemple on peut voir qu’une diminution de la quantité d’autophagosomes détectable dans la cellule peut être due soit à une activation de la dégradation (D) soit à un arrêt de la production (E), et une augmentation peut être le résultat d’un arrêt de la dégradation (C) ou bien d’une activation de la production (B). Sous traitement bafilomycine, les autophagosomes qui sont normalement dégradés sans bafilomycine vont maintenant être détectables au sein de la cellule (B’, C’, D’, E’). L’analyse de la différence entre la condition traitée avec bafilomycine et sans bafilomycine va permettre de rendre compte de la quantité d’autophagosomes dégradée et ainsi déterminer l’action du traitement. On peut voir qu’il y a une augmentation seulement dans la condition où il y a effectivement une activation du flux autophagique.

nous illustrons une technique proposée par [Jiang and Mizushima, 2015] pour l’étude de l’autophagie. Cette technique permet de déterminer le flux autophagique qui correspond à la quantité d’autophagosomes dégradés.