Chapitre 3 : Etude d’accepteurs de Michael en réaction avec la
3. Synthèse et évaluation in vitro d’une sonde profluorescente basée sur un pigment py razolone
3.2. Article 3 : Fast-Responsive and Water-Soluble Pyrazolone-based Fluorogenic Probe for
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En plus des différents biothiols présentés dans l’article, la sonde 142 est également capable de détecter du sulfure d’hydrogène qui est un gasotransmetteur, mais aussi un poison issu de la fermentation des algues vertes responsables d’empoisonnements sur les plages bretonnes. La sonde présente une exaltation de fluorescence d’un facteur 15 en présence de 50 équivalents de sulfure d’hydrogène à un pH de 7,4. De plus, une limite de détection de 20 nM a été mesurée à pH 7,4. Enfin, l’influence du pH sur la détection de ce gaz par la sonde a été étudiée et une bonne détection est obtenue pour un pH de 6,8 et 7,4. En dehors de cette gamme de pH (5-8), une chute drastique de la réponse lumineuse de la sonde est observée (Figure 37).
Figure 37 : Rapport des intensités de fluorescence de la sonde 142 (10 M) à T=0 et T=1 min en absence (bleu) et présence (rouge) de 50 équivalents de sulfure d’hydrogène à différent pH (tampon acétate (pH 3,95 et 6,78) tampon PBS
(pH 7,4) et tampon borate (pH 8,47)). ex = 410 nm.
4. Conclusion et perspectives
Ce chapitre a été consacré à l’étude de la réactivité des pyrazolones sur différents électrophiles, dont des accepteurs de Michael. Un partenaire offrant une excellente biocompatilibté mais également une réactivité satisfaisante avec les pyrazolones a été mis en évidence, il s’agit de la N -diméthylamino-mérocyanine 99. Une fois ce criblage terminé, trois stratégies ont été développées dans le but d’obtenir une ligation chimiosélective biocompatible entre les pyrazolones et les mérocyanines. Chaque nouvelle stratégie a été développée afin de pallier les problèmes re ncontrés lors du développement de la stratégie précédente. Toutefois, malgré les efforts déployés, les difficultés de synthèses ou de stabilité rencontrées n’ont pas permis d’aboutir à des résultats satisfaisants.
Néanmoins, les connaissances acquises lors de cette étude, notamment sur les pigments comportant une partie pyrazolone ont permis le développement d’une sonde profluorescente et hydrosoluble pour la détection spécifique de biothiols. Cette sonde permet de détecter les biothiols à un pH modérément acide (pH 5) avec une exaltation de fluorescence bien plus élevée qu’à pH 7,4 (fois 45 à pH 5 contre fois 15 à pH 7,4). Malgré cela, il serait intéressant d’étudier l’influence du TCEP sur la
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sonde 142. En effet, le TCEP est couramment utilisé pour la réduction de ponts disulfures lors du traitement de protéine. Ainsi, une compatibilité de notre sonde 142 avec le TCEP permettrait d’utiliser cette dernière pour l’étude structurelle de protéine par exemple. Une autre perspective d’utilisation de cette sonde serait une détection de biothiols comme le glutathion , par exemple, aux seins des lysosomes cellulaires. En effet, dans les lysosomes le pH est aux alentours de 5, ce qui devrait donc se traduire par une très bonne exaltation de fluorescence de la sonde. De plus, l’incorporation d’un motif morpholine sur notre sonde, devrait permettre de cibler précisément les lysosomes par rapport aux autres organites cellulaires comme les mitochondries ou le réticulum endoplasmique rugueux par exemple. En effet, l’amine tertiaire de la morpholine de par sa basicité augmente la pénétration des composés portant une telle entité au travers des membranes des lysosomes. Une fois entrée au sein des lysosomes, le pH suffisamment acide con duit à une protonation du motif morpholine (pKa = 7,4) ce qui aura pour effet d’empêcher l’expulsion du composé hors des lysosomes[41,42] (Schéma 102). Donc, in fine, une accumulation lysosomale des composés portant une morpholine.
Schéma 102 : Perspective pour l’obtention d’une sonde profluorescente pour la détection de biothiols au sein de lysosome.
De plus, la ligation aldéhyde/pyrazolone pourrait être rendue fluorogénique par l’utilisation de fluorophores comportant une fonction aldéhyde responsable d’un « quenching » de sa fluorescence[43,44]. Ainsi, après réaction avec les pyrazolones, la fonction aldéhyde disparait et un retour de fluorescence devrait être observé (Schéma 103), surtout après une double addition de pyrazolone (une photoisomérisation de la double liaison exocyclique, ou un phénomène d’ICT seraient toujours possible si la double liaison issue de la réaction de Knoevenagel est présente).
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Références: Chapitre 3
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